| 研究課題/領域番号 |
20K16971
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
柳川 享世 東海大学, 医学部, 助教 (10760291)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 肝発生 / 肝再生 / 線維肝 / エクソソーム / 再生医療 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、所属研究室が独自に見出した新規の線維肝再生促進因子であるOpioid growth factor receptor- like 1 (OGFRL1)について、OGFRL1ノックアウトマウスの表現型解析、OGFRL1のシグナル伝達経路の解析、OGFRL1の作用機序の解明という３つの主要項目を解析することで、線維肝の再生と胎仔肝の発生に共通するOGFRL1の分子機構を明らかにすることを目的としている。初年度である令和２年度は、主に以下の２点について達成した。
1) CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて樹立した複数系統のOGFRL1ノックアウトマウスの繁殖の過程において、出生率や生後の発育異常の有無を調べた。このOGFRL1ノックアウトマウスは、Ogfrl1の中央部に位置する保存領域より５’側または３’側に終止コドンが出現するようゲノム編集を行って作製した。異なる部位に対して遺伝子編集を行い、Ogfrl1の保存領域から欠損する系統と、保存領域以降を欠損する系統を作出することで、より詳細な機能解析を行えると考えられた。それぞれのノックアウトマウスの次世代は、概ねメンデルの法則に従った遺伝子型が出現していることを確認した。現在は、繁殖率の検討や出生後の表現型の観察を行っており、一部のノックアウトマウスを用いて肝傷害時のOGFRL1の解析に着手している。
2) 1)に続いて、Ogfrl1遺伝子内に大規模な欠損を持つノックアウトマウスを作製した。ゲノム上での大規模欠損を持つOGFRL1ノックアウトマウスは、前述1)の終止コドン挿入によるノックアウトマウスと異なり、全長の正常な転写産物、タンパク質が完全に作られなくなる。遺伝子編集個体が複数得られたため、現在は戻し交配を進めており、順次、出生率や新生仔における異常の有無の検討を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
複数系統のOgfrl1ノックアウトマウスについて、胎生致死であるか、遺伝子型別の出生率に差があるかなどについて、検討を行うことができた。戻し交配を進めており、胎仔肝の解析に着手する目途が立った。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度に引き続き、複数系統Ogfrl1ノックアウトマウスを用いた解析を行う。戻し交配が進んだ系統から順次、胎仔肝の解析や成獣における急性肝傷害の解析を予定している。胎児肝については、異なる胎齢で採材し、肝組織の構造や遺伝子発現を同時期の野生型マウスの胎仔肝と比較する。成獣における急性肝傷害の解析では、四塩化炭素やチオアセトアミド（TAA）を投与し、傷害の程度や傷害からの回復過程における変化を野生型マウスと比較する実験を予定している。
さらに、２年度目以降の計画として掲げたOGFRL1のシグナル伝達経路の解析およびOGFRL1の作用機序解明のため、Ogfrl1に蛍光タンパク質またはタグタンパク質を融合させたコンストラクトを作製し、細胞内局在等の解析に着手する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和２年度は、複数系統のOGFRL1ノックアウトマウスを維持・繁殖して検討を行ってきたが、新型コロナウイルス感染症拡大防止の観点から、一部の実験を縮小したため当初の予定よりマウス個体を減らさざるを得なかった。したがって、マウスの維持に係る費用が予定より少額となった。また、年度の途中から新たなOGFRL1ノックアウトマウスの作出を試みたため、次年度以降にこの維持・繁殖のための費用が多くかかることが予想された。更に、令和３年度以降に予定しているマイクロアレイ解析にかかる費用が高額であるため、複数回の検討を行えるよう、初年度の経費を調整した。
これらの理由から、当初の使用額の計画を変更して次年度へ繰り越しを行い、複数系統のOGFRL1ノックアウトの繁殖ならびに種々の解析に用いる予定である。
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