研究課題
HBVゲノムを標的としたgRNA(HBV-gRNA)とHBVやヒトゲノムを標的としないcontrol gRNA(Cont-gRNA)を設計した。これらいずれかとCas9を含むレンチウイルスベクター(HBV-gRNA/Cas9もしくはCont-gRNA/Cas9)をHBV感染後の初代培養ヒト肝細胞(PHH)に導入した。またgRNAのみを含むレンチウイルスベクターを導入したCas9誘導発現型HBV感受性肝癌細胞株(HepG2-hNTCP-iCas9)を作成し、HBV感染後にCas9発現を誘導した。併用治療に関してはDNA修復機構を標的としたsiRNAの導入もしくはPARP阻害剤（オラパリブ）の添加を行った。HBV-gRNA導入HepG2-hNTCP-iCas9にHBV感染後Cas9発現を誘導すると、Cont-gRNA導入群と比しcccDNA量・pgRNA量、培養上清中HBV DNA量、HBs・HBe抗原量が減少した。HBV感染PHHにHBV-gRNA/Cas9を導入すると、cccDNA量・pgRNA量、培養上清中HBV DNA量、HBs・HBe抗原量が減少した。HBV-gRNA導入HepG2-hNTCP-iCas9にHBV感染後Cas9を誘導すると、PARP活性が上昇した。HBV-gRNA導入HepG2-hNTCP-iCas9で、二本鎖DNA修復過程初期に関わるPARP2-HPF1経路や非相同末端修復（NHEJ）関連遺伝子LIG4を抑制すると、HBV感染後のCas9誘導による抗HBV効果が増強した。相同組換え関連遺伝子BRCAの抑制では抗HBV効果は増強しなかった。オラパリブでPARP活性を抑制した際にも、CRISPRによる抗HBV効果の増強を認めた。同様にHBV感染PHHでもHBV-gRNA/Cas9とオラパリブを併用した結果、CRISPRによる抗HBV効果の増強を認めた。
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