| 研究課題/領域番号 |
20K17177
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
岡本 師 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (60724200)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 家族性間質性肺炎 / 間質性肺炎 / エクソーム解析 |
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| 研究実績の概要 |
約40例の家族性間質性肺炎症例についてDNAサンプルを収集した。各症例につき臨床情報の収集、家系図の聴取を行い、また、DNAサンプルの濃度や質の評価を行った。そのうち家系図を含む臨床情報が十分に得られ、かつ若年発症であり、間質性発症者の多い家系を中心に16症例を選定した。
その16症例のDNAサンプルについて、タカラバイオに下記の内容を外注委託した。①サンプルの品質をBioanalyzerによる電気泳動および濃度測定を行い確認。②DNAサンプルを数百bpに物理的に断片化を行い、二本鎖DNAの両末端にアダプターを付加したフラグメントライブラリーが作製された。③SureSelect Human All Exon V6（アジレント・テクノロジー社）を用いてターゲット領域を濃縮し、タグ配列を有するプライマーを用いてPCR増幅を行い、シーケンスの鋳型となるDNAライブラリーを作製。④DNAライブラリーを混合し、NovaSeq システム（イルミナ社）を用いて、全エクソームシーケンスを行い、シーケンサー付属のソフトウェアにより塩基配列（リード配列）を得た。タグ配列に基づき塩基配列（リード配列）を分類された。塩基配列（リード配列）のファイルはFASTQ形式で納品された。
得られたFASTQ形式のデータをゲノムデータベースを用いてマッピングし、サンプルの変異ファイルを作成した。そのうえで、データの加工を行い、絞り込み解析を施行中である。FASTQデータからの遺伝子解析は、東京医科歯科大学疾患バイオリソースセンターの田中敏博・須藤毅顕と共同で行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画の時点では、2021年度、2021年度内に、DNAおよび臨床情報の収集、DNAサンプルを用いてエクソン領域の濃縮、ライブラリーの作成、次世代シークエンサーを用いて全エクソンシークエンスを行うことが目標であった。2020年度内にすでに全エクソンシークエンスが終了しており、2022年度の計画であった解析作業に入っている。ただし、解析結果次第では、今後も追加のDNAサンプルを用いて全エクソンシークエンスを追加する可能性がある。現在行っている遺伝子解析による結果を適切に解釈し、さらなるDNA検体の必要性を検討していく。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画通り、あるいは計画時点の想定よりも早く進んでいる。今後は16サンプルの全エクソンシークエンスの遺伝子解析を行う。マッピングからの変異ファイル（VCFファイル）の作成は終了しており、東京医科歯科大学疾患バイオリソースセンターの田中敏博・須藤毅顕と共同でデータの加工や絞り込み解析を継続していく。
解析結果からＤＮＡサンプルの追加が必要になった際のサンプルは調整済みである。その場合には迅速に同様のＤＮＡ処理・解析を行っていく。
解析により何らかの意義のある遺伝子多型を認めた場合、その遺伝子の機能解析を検討していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
全エクソンシークエンスに係る費用について、１６サンプル同時に外注へ提出したため予想よりも安価であった。得られたFASTQデータの解析を東京医科歯科大学疾患バイオリソースセンターに依頼したため、解析のための外注費用が不要となった。
解析結果次第では、DNAサンプルを追加で全エクソンシークエンスする必要がでる可能性がある。また、遺伝子解析で得られた結果を検証するために、遺伝子発現解析を含めた機能解析が必要となる可能性がある。
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