研究課題/領域番号 |
20K17361
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研究機関 | 順天堂大学 |
研究代表者 |
西貝 燕 順天堂大学, 医学部, 博士研究員 (80614007)
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研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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キーワード | 末梢血単核球 / 真皮線維芽細胞 / 創傷治癒 |
研究実績の概要 |
研究代表者に所属研究室は独自に開発した無血清生体外培養法(QQc)に単核球を供し作成した細胞(MNC-QQc細胞)の移植による創傷治癒の促進効果について背部皮膚潰瘍モデル動物(マウス、ブタ)を用いて証明した。しかしながら、MNC-QQc細胞が皮膚線維芽細胞に与える影響やその詳細なメカニズムは明らかになっていない。皮膚再生においてのMNC-QQc細胞の性質・機能の解明により、難治性皮膚潰瘍の発症機構や正常な皮膚再生機構解明の更なる発展が期待できる。 令和3年度では、in vitro実験を行い、MMC-QQc細胞の共培養による線維芽細胞の遊走能に及ぼす影響を評価した。ヒト由来線維芽細胞を培養し、ピペットチップで創(疑似創傷)を作成する(スクラッチアッセイ)。チャンバー内のMNC-QQc細胞と線維芽細胞を共培養し、線維芽細胞の遊走による創閉鎖をコントロール群(共培養無し)と比較する。閉鎖は遊走距離/時間(μm/h)及び開創の面積を画像解析ソフトにて算出し解析する。次に共培養の培養上清液を回収しマルチプレックスアッセイキットを用いて、細胞遊走に関連するサイトカイン・ケモカイン等の液性因子の発現をMNC-QQc細胞との共培養の有無で比較、網羅的分析し、真皮線維芽細胞遊走促進因子の候補分子を探索した。 非接触共培養実験では、MNC-QQ細胞共培養した線維芽細胞の遊走を促進し、Angiogenesis arrayの結果にて、MNC-QQ細胞培養上清液中のMMP-9が責任因子であることが示唆された。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
令和3年度では、ヒト皮膚線維芽細胞遊走に関連するサイトカイン・ケモカイン等の液性因子の発現をMNC-QQc細胞との共培養の有無で比較、網羅的分析し、真皮線維芽細胞遊走促進因子の候補分子を探索した。令和3年度に実施予定の実験について、1、ヒト由来線維芽細胞を培養し、ピペットチップで創(疑似創傷)の作成を成功した。2、ヒト由来線維芽細胞をグルコース負荷(30mM)して培養する疑似高血糖環境を作製し、MNC-QQ細胞と線維芽細胞を24時間非接触共培養した。scratch assayによるMNC-QQのヒト皮膚由来線維芽細胞の遊走促進効果を確認できた。3、創傷治癒促進因子のスクリーニングを行うため、MNC-QQ培養上清のAngiogenesis arrayを行って、MNC-QQc細胞との真皮線維芽細胞遊走促進因子の候補分子を見出した。
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今後の研究の推進方策 |
令和3年度において、in vitro細胞共培養実験で、繊維芽細胞遊促進因子の探索とグルコース負荷効果を解析し、MNC-QQc細胞が放出する創傷治癒促進に関わる責任因子を特定した。 令和4年度では、特定したMMP9を線維芽細胞に添加培養し、スクラッチアッセイを行い、線維芽細胞の創閉鎖を測定し、遊走促進作用を検証する。また、MNC-QQc細胞と共培養及びMMP9の添加培養した繊維芽細胞を回収し、western blot法により、創傷治癒促進に関わるシグナル伝達を解明し、MNC-QQc細胞の作用メカニズムを解明する。
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