| 研究課題/領域番号 |
20K17519
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
山室 大介 自治医科大学, 医学部, リサーチ・レジデント (20739255)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | NCEH1 / オキシステロール / 25-hydroxycholesterol / アポトーシス |
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| 研究実績の概要 |
コレステロール酸化代謝物であるオキシステロール類は様々な生理活性が報告され、多くの疾患との関連について報告がなされてきた。しかし、その詳細な分子機序は未解明な点が多い。その中、NCEH1欠損マウスから採取した腹腔マクロファージの培養液中にオキシステロール類のひとつである25-Hydroxycholesterol(25-HC)を添加すると、小胞体ストレス関連分子の発現とアポトーシスが顕著に誘導されることを我々は見いだした。この時、マクロファージ内の25-HC ester含量が小胞体で顕著に増加していた。従って、NCEH1欠損による25-HC esterの小胞体における蓄積が小胞体ストレス誘導を仲介し、アポトーシスを引き起こすことが示唆された。オキシステロール類の多くは核内受容体LXRにリガンドとして結合し、脂質代謝制御や抗炎症作用といった生理作用を引き起こす。25-HCはコレステロール輸送タンパクNPC1やオキシステロール結合タンパク(OSBP)へ結合し、ステロール代謝のみならず広範な細胞機能を調節する。25-HCはウイルス感染抑制作用、IgA産生抑制作用など主に免疫・炎症での作用が注目されているが、アポトーシス誘導の詳細な機序に関してはまだ未解明である。そこで本研究において内因性25-HC esterのアポトーシス誘導機序を解明し、マクロファージ細胞機能に対する25-HC esterの新たな生理活性を提示することは、生体内25-HC esterおよびNCEH1の動脈硬化症を始めとしたマクロファージ関連疾患における発症因子としての提示、さらには発症機序の解明へと発展することが期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
25-HC ester蓄積によって誘導されるNCEH1欠損マクロファージにおけるアポトーシス誘導の新たな分子標的の探索を行うにあたり、二次元電気泳動法(蛍光標識2D-DIGE 野生型: Cy3 ,NCEH1 KO : CY5, 内部標準 : Cy2) にて解析した。変動の見られた候補タンパクをwestern-blotting法にて比較解析した結果、13の候補タンパクのうちGalectin-3、Cathepsin Dといったタンパク発現量の増減が見られた。Galectin-3はマクロファージの接着・分化・増殖・遊走といった細胞機能に、Cathepsin D はマクロファージ泡沫化や動脈硬化プラークの形成・安定化に関与していることが報告されている。しかしながら、これらGalectin-3やCathepsin Dの阻害剤を同時添加しても25-HCによるNCEH1欠損マクロファージにおけるアポトーシス誘導への影響は見られなかった。また、野生型マウスの骨髄由来マクロファージに25-HCを添加すると、ISR(Integrated Stress Response)4経路のうちGCN2/eIF2α/ATF4経路などのアミノ酸飢餓シグナルが誘導されることでアポトーシスを引き起こすことが報告されている。そこで、NCEH1欠損による25-HC ester 蓄積がISR経路(GCN2、PERK、PKR、HRI、ATF6、eIF2α、peIF2α、ATF４など）を活性化するかどうかを調べた。その結果、25HC添加したNCEH1欠損マクロファージではGCN2/eIF2α/ATF4経路は誘導されず、PERK/eIF2α/ATF4経路が誘導されていた。今後、PERK/eIF2α/ATF4経路の更なる上流分子の解析を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、これまでにNCEH1欠損マクロファージに25-HCを添加することで、小胞体内25-HC esterが蓄積し、PERK/eIF2α/ATF4経路を介したアポトーシスが誘発され、マクロファージの細胞機能に関わるGalectin-3やマクロファージ泡沫化に関与するCathepsin D が発現増加することを明らかとした。今後、PERK/eIF2α/ATF4経路の更なる上流分子の解析を行うにあたり、オキシステロールの小胞体センサーを担うOxysterol binding protein (OSBPL)ファミリーの解析を行う。OSBPLファミリーをsiRNAにてノックダウンすることでPERK/eIF2α/ATF4経路およびアポトーシスが抑制または増幅されるかどうか検証し、OSBPLの上流分子としての可能性を検討する。また、25-HC free体による細胞への生理活性は近年報告されているが、細胞内25-HC ester増加を起因とした生理作用に関する報告はないことから、本研究ではNCEH1欠損マクロファージに対してLPS添加時の25-HC ester蓄積が細胞機能調節に関与するかを明らかにしたい。そこで、LPS添加条件下におけるマクロファージ細胞機能を解析する。マクロファージの細胞遊走能はBoyden Chamber Cell Migration assay kit、貪食能は Phagocytosis assay kit にて解析し、分化能に関してはフローサイトメトリー(FACS)を用いたポピュレーション解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウィルス感染拡大による緊急事態宣言発令に伴い、生化学的解析に必要な試薬等の海外からの納品に時間が掛ってしまい、試薬確保に遅れが生じたため、次年度使用額が生じた。この次年度使用額についてはsiRNAやRT-PCRなどのプライマー関連試薬を購入し、PERK/eIF2α/ATF4経路の上流分子の解析を行う予定である。
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