| 研究課題/領域番号 |
20K17536
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
寺坂 友博 岡山大学, 大学病院, 助教 (80721935)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ゴナドトロープ細胞 / 下垂体 / RNA結合タンパク / ZFP36 / mRNA代謝 |
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| 研究実績の概要 |
ゴナドトロープモデルLβT2細胞においては、同様の結合作用をもつELAV Like RNA Binding Protein 1 (ELAVL1)がゴナドトロピン分泌刺激ホルモン(GnRH)受容体およびGnRH刺激によるIEG mRNAを安定化する。そしてこの現象が、ゴナドトロピンの分泌調節に寄与することがわかってきた。それに対し、ZFP36はGnRHの刺激により発現が増加し、特異的に結合したmRNAの分解に働く。ゴナドトロープ細胞におけるZFP36によるmRNA代謝機構のゴナドトロピン分泌調節についての解明
を目指すために研究を進める。
今年度、FLAGタグ付加ZFP36の安定過剰発現細胞株LβT2(ZFP36-FLAG-LβT2)を作製済みであり、FLAGタグおよびZFP36の発現をウェスタンブロッティグ法で確認した。そして、FLAG抗体による免疫沈降法とZFP36抗体によるウェスタンブロッティグ法にて、ZFP36-FLAGのプルダウンを確認した。
また、このZFP36過剰発現株では定量RT-PCR法によりGnRHによるIEGであるEgr1の発現誘導が抑制され、3’UTRにAREを有するGnrhrの発現もELAVL1ノックダウン細胞と同様にコントロールと比較して低下していることが確認された。さらに、ウェスタンブロッティング法にてGnRHの刺激によるEGR1の産生がZFP36高発現株では減少することが示された。
EGR1はLHのβサブユニットの遺伝子Lhbのプロモーター領域に結合する転写因子として知られており、EGR1の発現が減少することによりLhbの発現は低下することが示唆される。つまり、GnRHの刺激により産生されたZFP36は転写因子の働きを抑制することにより、ゴナドトロピンの産生を制御している可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
LβT2細胞にレンチウイルスを導入したZFP36過剰発現株およびCRISPR-Cas9システムを用い傾向セルソーティングをしたZFP36 Knockdown株の作製はおおむね順調に進んでいる。ZFP36-FLAG-LβT2細胞を用い、抗FLAG抗体を用いたZFP36-FLAGと結合したmRNAのプルダウンを行うことを検討しているが、ZFP36による結合mRNAの代謝誘導のため、Realtime定量PCR法を用いた結合mRNAの種類は一部のmRNAの検出のみに留まった。そのため、すでに、AREを有したゴナドトロピン関連mRNAの3’UTRサイトのクローニングを済ませており、ルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3(Promega)にサブクローニングして、ZFP36の直接の働きを検討する手法を新たに追加する。すなわち、AREを有した3’UTR配列をもったpGL3を前述のpVXコントロール株とZFP36高発現株にトランスフェクションし、それぞれの株におけるルシフェラーゼ活性を対比することで、ZFP36の直接的なmRNAの保持作用を検討する。
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| 今後の研究の推進方策 |
LβT2細胞にレンチウイルスを導入したZFP36過剰発現株およびCRISPR-Cas9システムを用い傾向セルソーティングをしたZFP36 Knockdown株の作製はおおむね順調に進んでおり、各々の細胞株の機能解析を行っていく。それと同時に前記のAREを有したゴナドトロピン関連mRNAの3’UTRサイトのクローニングを済ませており、ルシフェラーゼレポータープラスミドpGL3(Promega)にサブクローニングして、ZFP36の直接の働きを検討する手法を新たに追加する。すなわち、AREを有した3’UTR配列をもったpGL3を前述のpVXコントロール株とZFP36高発現株にトランスフェクションし、それぞれの株におけるルシフェラーゼ活性を対比することで、ZFP36の直接的なmRNAの保持作用を検討する。
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