| 今後の研究の推進方策 |
(1) T細胞運動抑制因子の同定：好中球を PMA で刺激して得られた上清を超遠心でNETを除去した成分が活性化T細胞のケモタキシスを抑制する実験系で、加熱処理、neutrophil elastase (NE), pan-serineprotease inhibitor(PMSF), ATP, adenosineなどの物質を添加し、抑制現象の変化を検討する。また、rho, racなどの運動関連分子の変化をwestern blotにて検討する。
(2) NETのマクロファージ分化への影響の検討：健常人末梢血好中球をPMA で刺激して得られたNETを同じドナー由来のCD14(+)単球を3～7日間培養し、樹状細胞・M1, M2マクロファージへの分化を特異的表面抗原に対するモノクロナル抗体で染色し、flowcytometryで検討する。M1マーカーには、HLA-DR, CD80, CD83, CD86、M2マーカーにはCD163, CD206を用い、CCR2、CCR7などのケモカイン受容体、免疫チェックポイント分子PD-L1、L2も検討に含める。また、培養上清をストックし、マルチプレックス定量抗体アレイを用いて、それぞれの細胞のサイトカイン産生能を明らかにする。さらに、ケモカイン、CCL-2に対する遊走能をダブルチャンバーを用いたケモタキシスアッセイで検討する。
(3)より多数の胃癌・大腸癌切除標本におけるNETsの定量と臨床病理学的因子との相関性、CD4,CD8, CD68, CD163に対する抗体でも染色し、NETsとT細胞やM2マクロファージの浸潤様式との関連性を明らかにする。
(4) YTN16にPMA刺激でNETsを起こさせた好中球を混合しC57BL6マウス皮下に接種し、翌日よりDNAse (2000u/mouse)を隔日ごとに腹腔内投与し、腫瘍の成長速度を検討する。
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