2020 年度実施状況報告書

骨がんモデルマウスにおけるがん増殖とがん性疼痛における一次求心性線維の役割の解明

研究課題

研究課題/領域番号	20K17798
研究機関	大阪医科大学
研究代表者	長峯達成大阪医科大学, 医学部, 助教 (20867436)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2022-03-31
キーワード	カプサイシン処置 / IVIS / ルシファラーゼ
研究実績の概要	BALB/c妊娠マウスから出生した雄の新生仔マウスの生後0日目と2日目にカプサイシンあるいは溶剤を皮下投与し、カプサイシン処置マウスと非処置マウス(溶剤投与群)を作製する。蛍光タンパクGFPを発現する乳がん細胞株4T1-GFPを5-6週齢時となったカプサイシン処置および非処置マウスの右脛骨の骨髄腔内に1万個注入し、骨がんモデルを作製する。がんの進展の評価と痛みの定量として腫瘍の増殖をX線とイメージングシステムIVISで継日的に測定すると同時に、動的体重負荷測定装置(Dynamic Weight Bearing :DWB、Bioseb社製)を用いた行動評価で疼痛閾値を追跡評価した。研究代表者は予備実験で生直後カプサイシン処置により骨がんモデルで生存率が伸びるという結果を得ていたが、本実験では両群間で生存率、疼痛閾値ともに有意差はなかった。また、イメージングシステムIVISでGFPを検出できなかった。GFPの検出はin vivoでは非常に難しく、in vivoイメージングでは感度の面から蛍光よりも発光レポーターを使用する方が容易であることから再度ルシファラーゼを細胞株として使用し、IVISで撮影を行っている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由予備実験で生直後カプサイシン処置により骨がんモデルで生存率が伸びるという結果を得ていたが、本実験では両群間で生存率、疼痛閾値ともに有意差はなかった。また、イメージングシステムIVISでGFPを検出できず、マテリアルをGFPからルシファラーゼに変更し、再度IVISで撮影を行うこととしたため。
今後の研究の推進方策	ルシファラーゼを発現する細胞株4T1-Luc2(ACTT)でのIVISによるイメージングには成功しているため、腫瘍の進展に置いてカプサイシン処置および非処置マウスでの腫瘍の進展の差を調べる。「研究計画が予定通り進展しない場合」はカプサイシン処置の代わりにTrkAノックアウトマウスを用いて上記の実験を行い、無髄の一次求心性線維(C線維)の役割を検討する。
次年度使用額が生じた理由	GFPの検出はin vivoでは非常に難しく、イメージングシステムIVISでGFPを検出できなかった。 vivoイメージングでは感度の面から蛍光よりも発光レポーターを使用する方が容易であることから、当初計画していた腫瘍細胞を4T1-GFP細胞から発光レポーターであるルシファラーゼを細胞株とする4T1-Luc2へ変更した為に次年度使用額が生じた。次年度も引き続き行う、4T1-Luc2を移植したマウスの撮影費用（撮影前に腹腔内投与するLuciferinが高額）などと、その後の分子生物学的解析などに次年度使用額（829,738円）と令和3年度の研究費を使用する計画である。分子生物学的解析は、安楽死させた処置側脛骨と脊髄（L3-5部分）を摘出し、そこからRNAを抽出して免疫染色およびリアルタイムPCR法を用いて、各種染色を用いた疼痛関連分子を評価する。「研究計画が予定通り進展しない場合」はカプサイシン処置の代わりにTrkAノックアウトマウスを用いて上記の実験を行い、無髄の一次求心性線維(C線維)の役割を検討する。