| 研究課題/領域番号 |
20K17927
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
栗本 路弘 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (40806501)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 脳腫瘍 / ゲノム解析 / SNP / リキッドバイオプシー / IDH1 / TERT |
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| 研究実績の概要 |
遺伝子異常に基づく神経膠腫の病型分類に必要な遺伝子変異を術中に極めて短い時間でまとめて診断する技術を継続開発した。既に IDH1 変異に対して技術を確立したが さらに TERT、EGFR、BRAF、PTCH1などのhot spot 変異をもつ遺伝子変異に対してもプローブ開発を行い、多数の原発性脳腫瘍に対応できる術中オールインワン診断システムを構築し臨床応用を開始した。
これらの遺伝子変異の解析をすすめるため、利用可能な細胞株を検索し過剰発現細胞株を作成、強制発現プラスミドベクターを作成した。蛍光プローブであるQプローブを用いて、全自動 SNPs 解析装置 i-densyで解析した。上記解析の対象となった同一腫瘍組織の残検体を用いて、同定された異常があることをアンプリコンシークエンスにて変異を同定し比較対象とし、QIAamp DNAMini Kit (QIAGEN)を使用して腫瘍からDNAを採取、対象遺伝子および各染色体のhetero DNAに対して作成した Not Ⅰ配列付きプライマーを用いたPCRを行い対象領域のアンプリコンを作成、アンプリコンを Not Ⅰにてdigestion した後、T4 ligase にてligation を行うことにより長鎖 DNAを作成し、次世代シークエンサー用のアダプター配列をligationしHiseq 2500でシークエンスを行うことで、1%までの低アレル頻度の変異を高い正確性をもって判断することができた。染色体コピー数異常についてはさらに正確性を高めるため MLPA法を用いて再解析を行った。
また髄芽腫が疑われる患者に対し、上記で確立した技術を用いて摘出検体に対する遺伝子変異の術中迅速診断を試みた。引き続き、術前病理診断と術後確定病理診断とも比較し迅速遺伝子診断の有用性を評価する予定。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
GLI2、H3F3Aなどのhot spot変異に対しての解析を行ったが、強制発現プラスミドベクターの作成に困難を来した。また髄芽腫での術中迅速診断と術後確定病理診断とも比較にて有意な合理性を見出せず、方針の転換が必要と考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
GLI2、H3F3A強制発現プラスミドベクターの作成を再開する。これに成功すれば神経節膠腫や脳幹部神経膠腫との病理診断を得ている検体を使用して同様の解析を継続する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
国内での研究打ち合わせや学会での発表が感染流行のため実施することが困難であった。
物品費に関しては本年必要分が過少であったため、次年度以降は必要量が増加する見込みである。
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