2022 年度実施状況報告書

微量DNA捕捉ナノワイヤと迅速SNP検出装置を用いた脳腫瘍リキッドバイオプシー

研究課題

研究課題/領域番号	20K17927
研究機関	あいち小児保健医療総合センター(臨床研究室)
研究代表者	栗本路弘あいち小児保健医療総合センター(臨床研究室), 臨床研究室, 主任研究員 (40806501)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2024-03-31
キーワード	脳腫瘍 / ゲノム解析 / リキッドバイオプシー / IDH / TERT
研究実績の概要	遺伝子異常に基づく神経膠腫の病型分類に必要な遺伝子変異を術中に極めて短い時間でまとめて診断する技術を継続開発した。既に IDH1 変異に対して技術を確立したがさらに TERT、EGFR、BRAF、PTCH1などのhot spot 変異をもつ遺伝子変異に対してもプローブ開発を行い、多数の原発性脳腫瘍に対応できる術中オールインワン診断システムを構築し臨床応用を開始した。これらの遺伝子変異の解析をすすめるため、利用可能な細胞株を検索し過剰発現細胞株を作成、強制発現プラスミドベクターを作成した。蛍光プローブであるQプローブを用いて、全自動 SNPs 解析装置 i-densyで解析した。上記解析の対象となった同一腫瘍組織の残検体を用いて、同定された異常があることをアンプリコンシークエンスにて変異を同定し比較対象とし、QIAamp DNAMini Kit (QIAGEN)を使用して腫瘍からDNAを採取、対象遺伝子および各染色体のhetero DNAに対して作成した Not Ⅰ配列付きプライマーを用いたPCRを行い対象領域のアンプリコンを作成、アンプリコンを Not Ⅰにてdigestion した後、T4 ligase にてligation を行うことにより長鎖 DNAを作成し、次世代シークエンサー用のアダプター配列をligationしHiseq 2500でシークエンスを行うことで、1%までの低アレル頻度の変異を高い正確性をもって判断することができた。染色体コピー数異常についてはさらに正確性を高めるため MLPA法を用いて再解析を行った。また髄芽腫および頭蓋内胚細胞腫瘍が疑われる患者に対し、上記で確立した技術を用いて摘出検体に対する遺伝子変異の術中迅速診断を試みた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由新興感染症流行により施設間の移動ができなかった期間が長く、進行に多大な影響が出ている。
今後の研究の推進方策	引き続き、術前病理診断と術後確定病理診断とも比較し迅速遺伝子診断の有用性を評価する予定である。また、同研究グループ内で悪性リンパ腫に対しての迅速解析研究も開始しているため、同疾患に対しても解析を予定したいと思っている。
次年度使用額が生じた理由	進行感染症流行により研究自体の進行が大幅に遅れている。本年は行動規制も緩んだため過去のペースで研究を再開したい。最終的に海外学会での発表を実施する予定。