| 研究課題/領域番号 |
20K17944
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
落合 祐之 日本大学, 医学部, 研究医員 (20815469)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 鉄依存性細胞死 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度に見出したAPAMによる鉄依存性細胞死の性質を詳細に調べた。Annexin V染色を用いたフローサイトメトリーでAPAMではアポトーシスの増加は認められず、ウエスタンブロッティング解析でも切断型カスパーゼー３の出現が見られなかった。この結果は汎カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKが細胞死を抑制しない結果と一致しており、アポトーシスの関与は小さいと結論された。フェロトーシスを誘発するErastinはAPAM同様に膠芽腫の増殖抑制と細胞死を誘発するが、フェロトーシス阻害剤Ferrostatin-1および鉄キレーターBipyridylで抑制されたことから、フェロトーシスを誘発することが確認された。
APAM誘導細胞死ではミトコンドリアの断片化と単極性ミトコンドリア核辺縁部クラスター形成monopolar perinuclear mitochondrial clustering (MPMC)が誘導された。細胞死に先行してミトコンドリアのROS産生、カルジオリピン酸化、過酸化脂質の増加が見られた。一方、Erastin処理細胞では観察されなかったため、APAM誘発細胞死は鉄依存性であるが、フェロトーシスとは異なる。さらに、ミトコンドリア内の鉄Fe（Ⅱ）検出プローブ Mito-FerroGreenを用いた生細胞イメージングを行なった。無処理細胞ではミトコンドリア鉄は網状ネットワーク構造を示したが、MitoTracker Red染色によるミトコンドリア構造と必ずしも一致しなかった。APAM処理によって、ミトコンドリア鉄はMPMCと一致し、核の縮小・分解が観察された。これらの変化は、Bipyridylで抑制された。
これらの結果は、APAM誘発細胞死ではミトコンドリアROS蓄積で惹起される、ミトコンドリアの形態ならびに細胞内分布変化および核の傷害が重要な役割を果たすことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の成果の一つは、APAMによる細胞死には、カノニカルなアポトーシスやフェロトーシスとは異なることを明らかにしたことである。特に、鉄依存性であるにも関わらず、典型的な鉄依存性細胞死であるフェロトーシスとはメカニズムが異なるという知見を得られたことは大きな成果であった。この知見は、予想外であった。しかしながら、フェロトーシスの発見者であるStockwellらは、フェロトーシスにはミトコンドリアの関与がないことを報告しているので、彼らの結果と一致している。もう一つの成果は、APAMによる細胞死では、ミトコンドリアの状態、ダイナミクスならびに細胞内ポジショニングの変化が重要な役割を果たしているという知見である。特に、細胞内ポジショニングの変化であるMPMCはこれまで報告されていない細胞死に関連する新しいミトコンドリアの細胞内分布状態であり、その細胞死における関与の仕組みの解明が必要である。それに関して、ミトコンドリア鉄動態の変化とその抑制による細胞死、核傷害の減少が見られたことは興味深い。
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| 今後の研究の推進方策 |
ミトコンドリア内の鉄 Fe（Ⅱ）特異的な検出プローブ Mito-Ferro Greenを用いた生細胞イメージングで無処理細胞では網状ネットワークが観察されたが、必ずしもミトコンドリアを染色したMitoTracker Redと一致しなかった。これら結果は、ミトコンドリアの鉄含量には不均一性があること、すなわち、鉄が豊富なミトコンドリアと欠乏したミトコンドリアがあることを示唆しているので、ミトコンドリアを単離し、鉄を定量することでこの仮説を確かめる。また、鉄全体の変化ではなく、Fe（Ⅱ）特異的な変化である可能性がある。すなわち、鉄はFe（Ⅱ）ではなく、Fe（Ⅲ）として存在するために、MitoFerro Greenで検出されない可能性がある。APAMにより産生されるミトコンドリア内スーパーオキサイドが結合してFe（Ⅱ）がFe（Ⅲ）に変化することが化学的に想定できる。このようなレドックス変化が、鉄依存性細胞死に関与する可能性がある。そこで、単離ミトコンドリアのFe（Ⅱ）動態とスーパーオキサイドの負荷の作用を調べてこれらの仮説を検証する。
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