CRISPRライブラリーを用いた変形性関節症の原因遺伝子の網羅的解析

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K18002
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 久永 哲 熊本大学, 病院, 特任助教 (30827308)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 軟骨細胞 / 小胞体ストレス / 変形性膝関節症

研究実績の概要

熊本大学倫理委員会の承認の下に人工膝関節置換術を施行した変形性膝関節症患者の骨軟骨組織(KL grade 3:N=4, KL grade 4:N=11)を術中に採取した。また正常軟骨サンプルとして、大腿骨頸部骨折で人工骨頭置換術を施行された患者の骨軟骨組織(N=9)を採取した。これらのサンプルのRNA抽出および組織染色を現在行っている。
また小胞体ストレス反応遺伝子であるXbp1が結合する配列(UPRE配列)にGFPを挿入したレンチウイルスベクターを作成し、ヒト軟骨細胞株(C28I2)にCas9およびUPRE-GFP遺伝子の導入を行い、小胞体ストレスを感知する細胞を作成した。この細胞に対して、Human GeCKO lentiviral CRISPR Cas9 knockout pooled libraries (version 2)を導入し、その後GFP発現量の上下15%をFACSを用いて細胞のソーティングを行い、ゲノムDNAを抽出後に次世代シークエンサーでゲノム情報を取得し、小胞体ストレスに影響を及ぼす候補遺伝子群のリストを得た。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

解析に必要な臨床サンプルの採取が終了しており、また次世代シークエンサーを用いたGeCKO libraryの実験も終了している。

今後の研究の推進方策

現在患者より回収したサンプルの解析を行っており、前年度に終了した軟骨細胞でのデータと統合し、OAの要因となりえる遺伝子を同定し、軟骨細胞での機能を解析していく予定である。