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マウスの正常骨芽細胞の分離を再度試みた。日齢9までの正常マウスの頭骸骨を細切し、トリプシンおよびcollagenaseにて分解した。得られた細胞を培養し、生着した細胞株を継代し、増殖能および骨分化に関して検討した。形態的には間葉系細胞を得られ、複数回の継代および凍結融解も可能であった。増殖培地で70％コンフルエントに達する程度まで培養を行い、その後骨分化培地に変更の上、14日間培養を継続した。しかしながら、骨文化を認めず、培地条件や培養日数に変更を加えても同様であった。培養日数を延長すると分化が進むという報告もあり、35日まで延長したが、細胞の増殖を認めるのみであった。
一方、間葉系幹細胞の培養に関しては、増殖培地で70％コンフルエントに達する程度まで培養を行い、その後骨分化培地に変更の上、14日間培養を継続した。その後アルコールにてウェルを固定後に骨分化、主にミネラル化の程度を画像にて解析を行った。また、骨組織へのカルシウム沈着量を、アリザリンレッド染色で評価を行ったところ、良好な骨分化を得ることができた。また、過年度に行ったヒト骨芽細胞の培養実験と同様、最適な骨文化に必要なアスコルビン酸濃度に関して濃度を変更して検討し、適正濃度およびアスコルビン酸欠乏による骨分化への影響に関して検討した。
また、上記の間葉系幹細胞を培養し、培養上清からエキソソーム採取を試みた。間葉系幹細胞を十分量培養し、無血性培地に移し、上清を採取。カラム法にてエキソソームを採取した。
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