頭頸部癌における1分子RNAメチル化解析法の確立について

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K18277
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 望月 大極 浜松医科大学, 医学部附属病院, 助教 (40467246)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: RNA修飾 / ナノポアシークエンサー / m6Aシークエンス / エピトランスクリプトーム

研究実績の概要

DNAメチル化などの塩基修飾が癌化機構など多様な影響を与えることが広く認識されている。なかでも次世代シークエンサーの登場で近年分子生物学が発展し、RNA領域におけるエピトランスクリプトーム研究は広がりを見せている。我々はこれまで頭頸部癌において、腫瘍・正常検体を用いDNAメチル化を特に研究してきた。最近は、蛍光法を使ったRNAメチル化解析に取り組んだ。蛍光m6A測定法(EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit; Epigentek Group Inc.)にて頭頸部癌では癌部でm6A比率が高く、高m6A比率群は予後不良である結果を得ることができた。さらに、関連遺伝子群の解析及びノックダウン頭頸部癌細胞株を作成済みである。RNA修飾に関しての研究はまだ発展途上の分野である。我々は、頭頸部癌におけるRNA修飾に関して先駆的研究グループである。
さらなる次世代とよばれるナノポアシークエンサーは、酵素反応を必要とせず、さらにcDNAを経ず、RNAそのものが直接１分子ごとにナノ孔を通過する際に生じる微弱な電流を計測することで塩基分子を識別することが可能である。今回我々はRNAを直接測定することでRNA修飾を損なわずに行え、ナノポアシークエンサーを使用したRNAメチル化解析法の確立（Direct RNA-seq）を行い、よりRNA修飾の実態にそった頭頸部癌におけるRNAメチル化と癌化機構についての知見を蓄積していきたい。
本研究は、RNAを直接測定することでRNA修飾を損なわず、1分子ごと効率的に識別できるナノポアシークエンサーを使用したRNAメチル化解析法の確立を行い、よりRNA修飾の実態にそった頭頸部癌におけるRNAメチル化と癌化機構についての知見蓄積を目的としている。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

これまでの研究で、頭頸部癌の癌部と正常部ペア44サンプルについては通常のm6A量測定にて解析済みであり、継続的に手術検体及びHPV非関連頭頸部癌症例のリキッドバイオプシーとしてのcfDNA, cfRNAの収集作業を開始している。HPV関連癌におけるLiquid biopsy(cfDNA)のDNAメチル化マーカーの選定をシークエンサー解析で行い、経時的な計測と臨床情報が相関することを確認している。現在、RNAメチル化解析法の確立（Direct RNA-seq）に取り組んているところである。

今後の研究の推進方策

我々研究グループは、これまでのエピゲノム研究の経験から、ナノポアシークエンサーによる研究を頭頸部癌細胞株、手術検体のRNA修飾解析を行い、さらにリキッドバイオプシーによるリアルタイムでのモニタリングに応用にしていきたいと考えている。2021年度は、ナノポアシークエンサーを使った解析を始める予定である。

次年度使用額が生じた理由

2020年度は、リキッドバイオプシーによるctRNA回収の実験が主であった。2021年度は、RNAメチル化アレイに取り組む予定である。エピクリプトーム修飾の定量化など予算使用額が増加すると予想される。

研究成果

• [雑誌論文] 喉頭摘出術における咽喉皮膚瘻、合併症、栄養指標についての検討 (2021)
  • 著者名/発表者名: 望月 大極, 今井 篤志, 山口 裕貴, 岡村 純, 三澤 清, 細川 誠二, 峯田 周幸
  • 雑誌名: 耳鼻咽喉科臨床 補冊 巻: 156 ページ: 77-81
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Prostanoid receptor genes confer poor prognosis in head and neck squamous cell carcinoma via epigenetic inactivation. (2020)
  • 著者名/発表者名: Misawa K, Mima M, Yamada S, Imai A, Mochizuki D, Ishikawa R, Kita J, Yamaguchi Y, Endo S, Misawa Y and Mineta H
  • 雑誌名: Journal of Translational Medicine 巻: 18(1) ページ: 31
  • DOI: 10.1186/s12967-020-02214-1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Neuropeptide receptor genes GHSR and NMUR1 are candidate epigenetic biomarkers and predictors for surgically treated patients with oropharyngeal cancer. (2020)
  • 著者名/発表者名: Misawa K, Mima M, Yamada S, Misawa Y, Imai A, Mochizuki D, Nakagawa T, Kurokawa T, Oguro M, Ishikawa R, Yamaguchi Y, Endo S, Kawasaki H, Kanazawa Takeharu and Mineta H
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10(1) ページ: 1007
  • DOI: 10.1038/s41598-020-57920-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Overexpression of Sal-like protein 4 in head and neck cancer: Epigenetic effects and clinical correlations (2020)
  • 著者名/発表者名: Misawa K, Misawa Y, Mima M, Yamada S, Imai A, Mochizuki D, Nakagawa T, Kurokawa T, Endo S, Kawasaki H, Brenner JC and Mineta H
  • 雑誌名: Cellular Oncology 巻: 43(4) ページ: 631-641
  • DOI: 10.1007/s13402-020-00509-5
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] G protein-coupled receptor genes, PTGDR1, PTGDR2, and PTGIR, are candidate epigenetic biomarkers and predictors for treated patients with HPV-associated oropharyngeal cancer. (2020)
  • 著者名/発表者名: Misawa K, Imai A, Kanazawa T, Mima M, Yamada S, Misawa Y, Mochizuki D, Yamada T, Shinmura D, Ishikawa R, Kita J, Yamaguchi Y, Misawa Y and Mineta H
  • 雑誌名: Microorganisms 巻: 8(10) ページ: 1504
  • DOI: 10.3390/microorganisms8101504
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of novel methylation markers in HPV-associated oropharyngeal cancer: genome-wide discovery, tissue verification and validation testing in ctDNA. (2020)
  • 著者名/発表者名: Misawa K, Imai A, Matsui H, Kanai A, Misawa Y, Mochizuki D, Mima M, Yamada S, Kurokawa T, Nakagawa T and Mineta H
  • 雑誌名: Oncogene 巻: 39(24) ページ: 4741-4755
  • DOI: 10.1038/s41388-020-1327-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Long interspersed nuclear element 1 hypomethylation has novel prognostic value and potential utility in liquid biopsy for oral cavity cancer. (2020)
  • 著者名/発表者名: Misawa K, Yamada S, Mima M, Nakagawa T, Kurokawa T, Imai A, Mochizuki D, Shinmura D, Yamada T, Kita J, Ishikawa R, Yamaguchi Y, Misawa Y, Kanazawa T, Kawasaki H and Mineta H
  • 雑誌名: Biomarker Research 巻: 8 ページ: 53
  • DOI: 10.1186/s40364-020-00235-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 喉頭摘出術における咽頭皮膚瘻、合併症、栄養指標についての検討 (2020)
  • 著者名/発表者名: 1.望月大極、岡村純、今井篤志、山口裕貴、瀧澤義徳、三澤清、細川誠二、峯田周幸
  • 学会等名: 日本頭頸部外科学会