| 研究課題/領域番号 |
20K18380
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
小林 礼子 大阪大学, 医学系研究科, 特任助教(常勤) (10857874)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ヒトiPS細胞の遺伝子組み換え |
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| 研究実績の概要 |
ヒトiPS細胞で眼の発生を模倣するSEAM法を基盤技術として、眼の発生初期に発現する転写因子RAX遺伝子の生理学的な機能を詳細に解明するために研究を行っている。
具体的には、RAX発現細胞を可視化してその細胞の挙動を追跡できるようなイメージングシステムの樹立、RAX遺伝子ノックアウト細胞の樹立、そしてそれらの細胞を用いて、RAX発現細胞と関連する眼発生ネットワークの解析を行うことを目標としている。
①CRISPR/Casシステムを用いて、RAX遺伝子の発現に伴い蛍光蛋白質を発現する遺伝子組み換えヒトiPS細胞の樹立を試みている。現在は組み換え用ベクターとCas-gRNAベクターの作製を終え、トランスフェクション後の細胞の薬剤選択中である。遺伝子組み換えのコンストラクトは、RAX遺伝子の開始コドン直下にレポーター遺伝子RFPの配列と薬剤選択蛋白質のカセットを導入できるようにするものとした。初めの数回のトランスフェクションでは、あらかじめ検討した薬剤濃度ではうまく選択が行えなかったため、薬剤濃度を再調整しながら進めているところである。
②定量PCRによりSEAM誘導中のRAX遺伝子の発現解析を行っている。SEAM誘導後1～2週間でRAX遺伝子の発現が強くなる結果が得られているため、さらに日を刻んで分化誘導3日前から3日ごとに分化後2週間までの細胞を回収し、定量PCRを行った。その結果、RAX遺伝子の発現は培養中のコロニーの状態にも影響を受ける可能性があるとわかったので、サンプル回収時のコロニーの形態も記録しながら、複数回実験を重ねてデータを集めているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ターゲティングベクターの作製や薬剤選択の過程で、複数回の試行錯誤や検討が必要となり、その分予定より時間を多く費やしている。
当初の実験計画の方向性からは外れずに実験を進められている。
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| 今後の研究の推進方策 |
①RAX発現細胞を可視化できる遺伝子組み換えiPS細胞が得られた後には、SEAM形成を行い、眼の初期の発生においてその細胞がどのような挙動を示すのかをタイムラプス顕微鏡で継時的に観察していく。
②SEAM形成初期におけるRAXやその他の眼の発生に関連する遺伝子の発現解析を引き続き行う。
③RAX遺伝子ノックアウトヒトiPS細胞を作製し、SEAMの発生に与える影響を観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度はレポーター遺伝子を導入したiPS細胞の樹立が完了しなかったため、蛍光顕微鏡を用いたタイムラプス観察を行わず、物品費の一部として請求した交換用ランプの購入を行わなかった。また、新型コロナウイルス感染拡大により学会の参加がオンラインとなったため、請求していた旅費を使用しなかった。
次年度に遺伝子組み換えiPS細胞の樹立が完了した際には蛍光顕微鏡の使用頻度が上がり、ランプの消費が予想されることと、イメージング画像処理ソフトの購入も予定しているため、翌年度分の助成金と合わせて使用する計画としている。
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