感染による角膜内皮細胞の機能変換の病態解明

2021 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K18381
• 研究機関: 鳥取大学
• 研究代表者: 春木 智子 鳥取大学, 医学部附属病院, 助教 (90838153)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: 間葉転換 / 角膜 / 角膜内皮細胞

研究実績の概要

水疱性角膜症は、角膜混濁による失明の原因として重要である。水疱性角膜症は角膜における内皮細胞の機能不全によって引きおこされる。その重要な原因として、加齢のみならず単純ヘルペス（HSV）をはじめとする角膜や前眼部の感染がきっかけとなる。こうした角膜内皮細胞の機能障害は角膜内皮細胞の間葉転換（MT）をきっかけとして生じいったん間葉転換をおこすと正常な機能は復元できない。
そこで間葉転換を入れるスイッチを探索するため、角膜内皮細胞へのHSV感染モデルを採用し検証をすすめつつある。この角膜内皮細胞感染刺激モデルを用いて転写ネットワーク解析を行った。その結果、感染モデルネットワークにおいては、Wnt family member 1(WNT1)、Notch、Smadなどの間葉転換に重要な役割をはたす分子群の関与を見いだした。さらに、感染後角膜内皮における転写ネットワークにおけるmaster regulatorを探索した。Master regulatorの一つとして　interferon regulatory factor 7（IRF7）を見いだし、その寄与を検証した。
HSV感染後の角膜内皮細胞の主要ネットワークは、抗原提示機能である。抗原提示細胞においては、種々の環境刺激において、小胞体ストレスが誘導され、抗原提示機能に影響する。また。小胞体ストレスは間葉転換を誘導しえる。このため、抗原提示機能、ひいては小胞体ストレスに影響しえる因子を探索した。その結果、感染後角膜内皮において誘導されるIRF7は、抗原提示機能に必須であるMHC class I分子の感染後誘導に必須であることが判明した。引き続きこの経路の間葉転換への寄与を検証しつつある。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

角膜内皮細胞における間葉転換の誘導に関わる経路として、ウイルス感染が重要であることが判明している。古典的間葉転換経路が、いかに炎症ストレスとクロストークするのかの解析をすすめつつある。
角膜内皮細胞において、間葉転換の指標となる分子としてVimentin、 E-cadherin、αSMAがあるが、経路の詳細を明らかにするため、間葉転換の関与する分子群（KLF4, DLL1, Notch1, TWIST1/2, SLUG, SNAIL, ZEB1/2）の寄与をさらに検証している。
これまで、IRF7が感染後ストレスネットワークのmaster regulatorとして重要であることが判明した。しかし、IRF7が間葉転換の制御に直接寄与するのか間接的なのかの詳細は明らかではない。そこでまず転写レベルにおける寄与、転写後調節への寄与を含める必要がある。まず、可能性の高い転写レベルにおける調節における寄与を明らかにすることを目的に、間葉転換因子群へのプロモータへの寄与の解析を試みつつある。このため、Wnt/β-catenin Signaling Pathwayを含めた間葉転換制御のためのプロモータアッセイをセットアップしつつある。
これまで判明している制御因子は、IRF7を含めた転写因子群の寄与が判明している。しかしながら、臨床応用をめざす場合、より直接的な間葉転換の制御ストラテジーも検討する必要がある。このため、Wnt経路の制御化合物探索のため、汐田教授との共同研究を開始した。これにより、新規制御化合物の検証、さらには、IRF7を含めたmaster regulatorとのクロストークの解析に入りつつある。

今後の研究の推進方策

間葉転換は、一般に初代培養細胞系でみられる現象であり、安定して間葉転換実験系を探索的に確立することは困難である。ひとまず、この技術的問題点を回避するため、本研究においては、不死化培養角膜内皮細胞系を用いて間葉転換の制御機構を探索している。また、この培養細胞系においては、ウイルス感染刺激において、VimentinやE-cadherinの誘導が安定的に観察できることを確認できている。さらに、経路の検証のためには、遺伝子編集や遺伝子欠失細胞での検証が必要である。これらの検証に関しても、細胞株においては容易であり、細胞株も樹立している。
一方、本研究は、臨床応用を念頭においているため、平行して間葉転換制御の標的薬剤のスクリーニングも必要とする。このためには、たとえば、Wnt経路を阻害する薬剤探索のための化合物スクリーニングが一つの手段となる。このため、これらの化合物スクリーニングを行ってきた汐田教授との共同研究を開始した。候補阻害化合物を用いて、角膜内皮細胞に対して毒性があるかどうかの検証をlive/dead assayを用いて開始した。さらにVimentinやE-cadherin誘導が制御できるかの検証をまず免疫染色及びRT-PCRを用いて開始している。引き続きプロモータレベルでの制御の検証を予定している。
これらをあわせて、炎症にかかわるネットワークとWntを介するネットワークが間葉転換にいかに関わり、かつ制御されえるのかを含め、臨床応用を念頭に検証をすすめつつある。

次年度使用額が生じた理由

研究を計画的に進めるために、年度末にまとめて物品を購入するのではなく、次年度に繰り越して有効的に使用するため。

研究成果

• [雑誌論文] Role of interferon regulatory factor 7 in corneal endothelial cells after HSV-1 infection (2021)
  • 著者名/発表者名: Ohtani F, Miyazaki D, Shimizu Y, Haruki T, Yamagami S, Inoue Y
  • 雑誌名: Scientific reports 巻: 11 ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41598-021-95823-9
  • 査読あり