| 研究課題/領域番号 |
20K18540
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
ジャウディン エスエム 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 客員研究員 (80868141)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 歯石 / 歯周病原細菌 / 上皮 |
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| 研究実績の概要 |
歯周炎患者では歯石沈着により症状が悪化することが知られているが、研究代表者は歯石中のリン酸カルシウム結晶がNLRP3インフラマソームを活性化してマクロファージのIL-1β産生を誘導し、さらに歯肉上皮細胞にピロトーシスと呼ばれるインフラマソーム依存性細胞死を誘導することを明らかとした。歯肉上皮細胞にピロトーシスが誘導されると歯肉溝/歯周ポ ケットにおける上皮バリアが破壊され、プラーク中の細菌の侵入を許し、歯周組織破壊がさらに進行する。本研究では、歯周ポケット上皮バリア破壊における歯石および歯周病原細菌の役割を明らかにするために、これらを用いて歯肉上皮細胞を刺激し、細胞傷害性試験、細胞シート透過性試験、スクラッチ試験で細胞および細胞シートへの傷害性を比較することとした。また、歯肉上皮細胞に対する歯石および歯周病原細菌の細胞傷害性の特徴および細胞死誘導メカニズムについて、マクロファージをコントロールとして解析することとした。
令和2年度は、歯石と歯石中に含まれる結晶成分として合成ハイドキシアパタイト(HA)(市販の 40 nm、150 nm、<2 μm のもの を購入)を使用した。歯石およびHA結晶、歯周病原細菌としてAggregatibacter actinomycetemcomitans、Fusobacterium nucleatumの凍結乾燥菌体に、歯肉上皮細胞HSC-2を暴露した。細胞傷害性を細胞内から放出される乳酸脱水素酵素(LDH)測定試験で測定したところ、歯石およびHA結晶に凍結乾燥A. actinomycetemcomitans、F. nucleatumよりも有意に強い細胞傷害性が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和2年度は、歯周病患者から採取した歯石を粉砕して歯石粒子として実験に使用するとともに、歯石中に含まれる結晶成分として合成ハイドキシアパタイト(HA)(市販の 40 nm、150 nm、<2 μm のもの を購入)も使用した。歯周病原細菌としてAggregatibacter actinomycetemcomitans、Fusobacterium nucleatumの凍結乾燥菌体を使用した。口腔上皮癌由来のHSC-2細胞を歯石およびHA結晶、凍結乾燥A. actinomycetemcomitans、F. nucleatumに暴露し、細胞傷害性を細胞内から放出される乳酸脱水素酵素(LDH)測定試験で測定したところ、凍結乾燥歯石およびHA結晶に凍結乾燥A. actinomycetemcomitans、F. nucleatumよりも有意に強い細胞傷害性が認められた。
一方、コントロールとして使用したPMAでマクロファージ様細胞に分化させたTHP-1細胞では、歯石およびHA結晶よりも凍結乾燥A. actinomycetemcomitans、F. nucleatumに強い細胞傷害性が認められた。
これらの結果から、本研究の第１の目的である歯石結晶と歯周病原細菌の歯肉上皮に対する細胞傷害性の違いは明白となり、１年目の研究成果としては、概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和3年度は、まず、メンブレンフィルター上に歯肉上皮細胞HSC-2がコンフルエントになるまで単層培養し、この細胞シート上に歯石およびHA結晶、歯周病原細菌を添加し、低分子量蛍光物質または色素による透過性試験を行う。この解析から、HA結晶および歯周病原細菌が上皮細胞のバリア機能の破壊に及ぼす影響を比較する。
次に、 歯肉上皮細胞HSC-2をセミコンフルエントになるまで単層培養し、HA結晶または歯周病原細菌存在下でスクラッチテストを行い、細胞遊走および創傷治癒への影響を比較する。この解析から、結晶粒子および歯周病原細菌のどちらが、上皮細胞単層培養に形成された 創傷の治癒を阻害しやすいかを判定する。
さらに、歯肉上皮細胞HSC-2をHA結晶と歯周病原細菌に暴露し、細胞死の誘導されるメカニズムの違いについて解析する。細胞死には、外傷などによって誘導されるネクローシスとプログラムされた細胞死であるアポトーシス、両者の特徴を合わせ持つピロトーシスやネクロトーシスなどが存在する。結晶粒子はピロトーシスを誘導し、菌体成分はアポトーシスやピロト ーシス、ネクロトーシスを誘導することが知られているが、歯肉上皮細胞にどのような細胞死が誘導されるか解析する。また、コントロールとしてPMA処理したTHP-1細胞を用いてマクロファージの細胞死の誘導メカニズムと比較する。
これらの解析から、歯肉上皮細胞の細胞死の誘導メカニズムが明らかとなれば、その細胞死を抑制するための方法の開発にもつながると考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和2年度は、歯石と歯石中に含まれる結晶成分として用いた合成ハイドキシアパタイト、歯周病原細菌として用いたAggregatibacter actinomycetemcomitans、Fusobacterium nucleatumの凍結乾燥菌体の口腔上皮細胞HSC-2に対する細胞傷害性試験については概ね順調に進行した。しかしながら、令和2年度は年度始めより新型コロナウイルス感染症が拡大しており、必要な試薬の購入にも影響が出た。試薬の生産および海外からの輸送等の遅れのため、予定していた物品の購入費も減少した。また、調査研究のために予定していた国内および国外での学会への参加も、全て現地開催が中止となり、旅費を使用する必要がなくなった。これらの原因から、次年度使用額が生じた。
令和3年度は、歯石および歯周病原細菌の上皮細胞のバリア機能に与える影響や、創傷治癒に与える影響、上皮細胞およびマクロファージおける細胞死誘導メカニズムの解析を予定しており、そのために必要な実験器具の購入費が必要となる。また、延期となった学会の旅費にも充てる予定である。
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