| 研究課題/領域番号 |
20K18735
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| 研究機関 | 和歌山県立医科大学 |
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研究代表者 |
中西 隆 和歌山県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (80772582)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 舌神経損傷 / 断端神経腫 / 末梢神経再生 / シュワン細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、ヒトの断端神経腫に含まれる神経再生促進因子を添加した人工神経管の神経再生能の評価と開発を進めていくことであり、中空の内腔構造の改善がされた人工神経管の更なる神経再生の向上を目指すものである。まず、マウス坐骨神経損傷モデルの作成を行うため、環境整備と手術手技の獲得を行い、顕微鏡下での坐骨神経の切除と吻合を行った。手術手技としては、三種混合麻酔薬を腹腔内注射し麻酔した雄のマウスを使用し、左側の坐骨神経を剖出し、露出した坐骨神経を4mm切断した後に両断端の坐骨神経を十分に剥離して牽引し、顕微鏡下で10-0ナイロン糸を用いて直接吻合した。その後、筋膜・皮膚を
4-0絹糸で縫合し、マウスを覚醒させた。また、坐骨神経を直接吻合した群と人工神経管を間に挿入し神経吻合を施行した群とで比較検討するために、切除した坐骨神経管に準備していた7mmの人工神経管を挿入し、10-0ナイロン糸で縫合し、同様に4-0絹糸で閉創した。作成した直接吻合したマウスと人工神経管を挿入したマウスを手術の７・14・28・42・56・84日後に足底部の疼痛閾値試験を用いて行動解析を行った。７・14・28・42・56・84日後にイソフルランで速やかに安楽死させた後、縫合した部位の坐骨神経を剖出し、切除部位より末端の神経組織と施術側のヒラメ筋と腓腹筋を切除し、パラフィン標本とした。抗S100βと抗PGP9.5抗体を用いて神経組織を、抗SERCA1抗体を用いて免疫組織学的に評価していく。さらには、加えて人工神経管に神経再生促進因子を添加し、評価していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
マウスの坐骨神経損傷のモデルを作成し、その環境と習得した手術手技を応用し、各モデルを評価していくように努め、特定のタンパク質を用いた人工神経管を使用する予定であった。
初年度で確立した坐骨神経損傷モデルのマウスを直接吻合の群と人工神経管を間に介入させた群で評価を行った。麻酔下で施術したマウスが覚醒した後、ゲージにもどし、十分に歩行・立ち上がることができないため、餌と水分をゲージの底に置くようにし、飼育再開した。神経吻合したマウスを処置後７・14・28・42・56・84日目に坐骨神経の再生評価を行った。当初はホットプレート試験を行う予定であったが、切断していない四肢がホットプレートに反応をしめすため、飼育途中の神経再生評価は、網目状の床にマウスを設置しフィラメント線を用いた足底部の疼痛閾値試験と視診による評価とした。手術直後は伸展していた大腿部も14日目以降には屈曲し歩行するようになった。84日目のマウスから切除した坐骨神経の末梢部位とヒラメ筋・腓腹筋を摘出し、標本作成後、免疫組織学的に、神経の軸索の数や太さ、神経線維の太さ、 シュワン細胞の存在比率・支配筋の異縮率を比較検討したが、直接吻合群と人工神経管介入群ともに十分な回復を認めたため、予定を変更し、損傷後、７・14・28・42・56日に分けて、標本作成を行い、比較検討を行った。次に、蛋白質を添加した人工神経管を用いたマウスについても評価する予定であったが、実際に特定のリコンビナントタンパク質を添加した人工神経を作成することが困難であり、研究の遅延につながっている。また、研究施設から離れた病院施設から離れた臨床現場で勤務しているため、十分に研究日や研究時間が確保できず、研究の遅延につながっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度、二年度で、坐骨神経を損傷し直接吻合を施行した群と神経再生促進因子無添加の人工神経管を介入した群の施術と評価を行い、それぞれの評価方法を確立した。損傷後の期間に差をつけ、標本作成し評価していった。ここから、ヒトの断端神経腫に含まれる神経再生促進因子を添加した人工神経管の神経再生能の評価が必要である。使用する人工神経管は神経再生促進因子を注入した人工神経管を用いるが、その他の手術手技や評価方法は確率した研究内容通りに行った通りに行えばいいが、特定のリコンビナントタンパク質を添加した人工神経管の作成が困難である。実際に添加するタンパク質は宿主が大腸菌のリコンビナントタンパク質を水溶液に溶解させ、乾燥した人工神経管に浸透させ膨潤させる予定であるが、リコンビナントタンパク質を入手が困難ことから始まり、十分に人工神経管に浸透・膨潤させることが困難であった。実際に幹細胞を人工神経管に添加した組織や商品開発をした組織と相談し、改善して行く予定である。
すべての群のマウスの評価が終了した後に、コントロール群としての直接吻合術群と無添加人工神経管使用群も含めた、それぞれの群の神経再生評価を比較検討する。その後、各マウス群の神経再生能を比較した研究結果を総括し学会発表、論文作成を行っていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由として、研究の遅延が生じたことがあげられる。蛋白質を添加した人工神経管を用いたマウスの評価において、特定のリコンビナントタンパク質を添加した人工神経を作成することが困難であり、研究の進行したいない。また、研究者当人が研究施設から離れた病院施設から離れた臨床現場で勤務しているため、十分に研究日や研究時間が確保できず、研究の遅延につながっている。次年度使用額の使用計画として、最も課題となる蛋白質を添加した人工神経管の作成に努め、成果を出すことを目標とする。
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