| 研究課題/領域番号 |
20K18741
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| 研究機関 | 日本歯科大学 |
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研究代表者 |
辺見 卓男 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (20814883)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 口腔癌 / 扁平上皮癌 / 早期悪性病変 / 腫瘍性異型 / 反応性異型 / 腫瘍間質 / 癌微小環境 |
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| 研究実績の概要 |
口腔粘膜の扁平上皮癌（口腔癌）は、早期にリンパ節転移をきたして生命を脅かす。早期発見が重要であるが、粘膜上皮の悪性変化は緩徐に進むうえ、口腔内は外来刺激による慢性炎症が重なっていることから、臨床的にも病理学的にも初期の腫瘍性変化を見極めることは難しい。本研究では、粘膜が癌化する過程において、上皮下の非腫瘍性（間質）細胞との相互作用が鍵になると想定し、舌表在性病変における異型上皮－間質要素間相互作用の分子基盤を明らかにすることを目指している。
先行研究での準備状況として、口腔癌の疑いで全摘切除された舌の組織診標本を用いて、上皮細胞骨格マーカー（CK13, CK17）、癌幹細胞マーカー（Bmi-1, CD44）、増殖活性マーカーKi-67や癌抑制因子p53の免疫組織化学的検索を行い、異型上皮領域と各種マーカー分子発現陽性細胞の局在との相関を明らかにしてきた。
初年度の実験計画として、変異誘発による粘膜炎マウスモデルにて舌上皮の形質変化の追跡、異型形質マーカーや結合組織へのシグナル伝達を担う候補遺伝子・タンパクの同定を予定、また、患者検体を用いた解析では、舌表在性病変における異型上皮分布の免疫組織化学的な検索、リンパ節転移に繋がる組織変化との相関の検証を予定していたが、これらの実験を延期し、実績としてはヒト外科切除検体解析の準備を進めるに留まっている。今後、口腔粘膜上皮の異型変化に関わる分子要素を明らかにするための粘膜炎モデルの作出を進めていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
年度初頭からのCOVID-19拡大の影響で、計画していた実験の遂行が困難となった。動物モデルを使用した実験は中止し、これまでに確保しているヒト症例を用いたマーカー分子発現の再整理を中心に組織所見の検索を行った。初期の組織変化に関しては、pT1/T2相当の舌扁平上皮癌の浸潤様式分類（YK分類，INF，簇出，WPOI-5）と異型上皮形質の発現様式との関連性について検索した結果、様式分類によらずリンパ管侵襲、静脈侵襲、神経周囲浸潤などの病理組織学的因子が有意に高率であることを確認した。また、今回の研究期間では、Gene Expression Omnibus（GEO）で公開されている遺伝子発現データセットを活用し、各種プログラム（R〈edgeRパッケージ〉・Python・Metascape）を用いて発現変動遺伝子の抽出とエンリッチメント解析を試行した。舌癌と健常対照との比較において、免疫応答、胎生期形態形成、細胞外基質や骨格系の発育に関わる遺伝子群が発現上昇する一方、核酸・脂質代謝、上皮形質やタイトジャンクションに関わる遺伝子群が発現減少を示すなど、今後の実験試料での分子基盤解析の参考となるデータを得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
粘膜炎モデルについて各種条件検討を進める。本実験では、マウス舌粘膜に「腫瘍性」と「反応性」の異型状態に加えて「腫瘍性＋反応性」の複合病態を設定し、形態変化と分子発現の比較解析を試みる。「反応性」群は麻酔下で硬毛ブラシでの舌側縁部の反復擦過により作出、「腫瘍性」群はDNA変異原性を持つ4-NQOを舌側縁部に継続塗布することで軽度～高度の段階的な異型状態を作出する。「腫瘍性＋反応性」群については、4-NQO塗布の最終週にブラシ擦過を併行することで炎症反応を付加する。炎症の慢性経過（～８週）以降の長期観察群としては20週前後まで追跡できる条件を検討する。病変組織から上皮層と上皮下結合組織を顕微切断し、RNA精製・マイクロアレイ解析を実施、リアルタイムPCR・免疫染色で発現量・分布を検証する。RNA抽出に併行して得られたタンパク画分はサチュレーションラベリング法による微量タンパク分析に供する。特に結合組織試料では、分化・増殖シグナル経路および代謝活性の指標となる転写因子群、特に早期転移の指標としてリンパ管内皮の形質変化に注目する。以上の実験で得られたマーカー候補分子については、申請者が先行研究で確立した診断マーカーの統合解析システムを応用して、順次粘膜組織における発現分布の検証および局在パターンのロジスティック解析にて相関を確かめる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【理由】COVID-19拡大の影響で実験実施予定が組めなかったため、実験動物・試薬の購入を見送った。
【使用計画】粘膜炎・変異誘発実験に供する動物・試薬の購入費とマイクロアレイ解析費用として計上するほか、タンパク画分の解析に必要なマイクロプレートリーダーが老朽化により作動しなくなったため、次年度の実験内容も一部変更のうえマイクロプレートリーダーの新調に予算を充当する。
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