| 研究課題/領域番号 |
20K18756
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
水川 朋美 岡山大学, 大学病院, 医員 (60868412)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | TMJ-OA / CCN3 / 糖代謝 / 転写因子 / エンハンサー領域 / 軟骨細胞 / 解糖阻害 |
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| 研究実績の概要 |
本申請課題ではTMJ-OAの発症を阻止し、傷ついた軟骨を修復する新しい治療法を生み出すための基盤を築くことを目指す。そのために軟骨細胞でOA様変化をもたらす局所的糖代謝不全が、関節軟骨の成熟に深く関与するCCN3を強く発現誘導することに着目し、どのような分子がそれを媒介しているかを明らかにすることを目的とする。本課題開始時点でこのCCN3発現制御は転写段階で行われていることが分かりつつあったため、令和2年度は解糖系阻害によるCCN3遺伝子発現誘導現象の確認から始め、軟骨細胞においてCCN3を解糖系阻害下で誘導するエンハンサーの決定、エンハンサーに結合する転写因子の同定へと研究を進めた。その結果、まずHCS-2/8細胞、ヒト乳がん細胞株MCF7およびMDA-MB-231細胞においてMIA、NaFによる解糖阻害およびグルコース飢餓状態によってCCN3の発現が上昇することが確認され、解糖系によるCCN3制御は軟骨細胞だけでなく他種細胞でも機能していることが分かった。また、このCCN3の誘導はmRNAレベルだけでなくタンパク質レベルでも確認された。さらに、レポータージーンアッセイで見出されたエンハンサー領域の塩基配列、MCF7細胞における同領域のヒストン修飾、転写因子結合状況を解析し、この制御を媒介する特定の転写因子としてRFX1を候補として得た。RFX1は解糖阻害により発現が誘導され、CCN3の発現誘導に必要であることが明らかになった。なお解糖阻害条件下で抗CCN3抗体でCCN3を吸着してしまうと、軟骨細胞のviabilityが低下することも示された。
これらの結果から、軟骨においてCCN3は、細胞を飢餓状態に順応させる役割を担っていると推察され、解糖不全に対する軟骨細胞の反応として、CCN3の発現上昇が転写因子RFX1を介して制御されていることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
令和2年度は解糖系阻害によるCCN3誘導現象がHCS-2/8のみならずMCF7細胞およびMDA-MB-231細胞でも観察されることを確認した。さらにHCS-2/8細胞における解糖系遮断によるCCN3の発現誘導を媒介するエンハンサー領域をレポータージーンアッセイで絞り込んだ。また、ENCODEポータルサイトの転写因子ChIPデータベース解析などの各種in silico解析を用いて、当該エンハンサーに結合する転写因子RFX1を推定し、CCN3遺伝子の発現上昇の制御を媒介する転写因子であることを実験的にも証明できた。これらの点から、令和2年度末の段階で、すでに研究期間内で達成すべき最低目標はほぼ達成していると考え、当該年度の研究進捗状況は予想以上であると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度に見出された転写因子RFX1が、実際に解糖系阻害によるCCN3誘導に関与していることは一応実証できているが、まだ検討すべきことは残っている。例えばRFX1タンパク質が解糖阻害で増加するか、エンハンサーへの結合性が変化するか、強制発現で何が起こるかなどを今後評価する必要がある。これに加え、当初の計画通りRFX1機能を阻害、および増強する小分子の探索に移る。RFX1がCCN3制御転写因子とわかってからまだ日は浅く、すでにそのような小分子が同定されているかも十分調査し切れていないため、令和3年度はそこから始める。並行して、新小分子スクリーニングのための化合物ライブラリの探索と選定も進め、最終段階であるOAモデル動物を用いたin vivoでの効果検証まで到達することを目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成2年度は新型コロナウイルス感染の拡大のため、年度前半は大学での実験などの研究活動が制限を受けた。そのため実験に用いる消耗品のための支出が減ったことに加えて、費用のかかるトランスクリプトーム解析を行う代わりに、公開されているビッグデータを解析して研究を進める他になかった。しかしその結果、皮肉なことに研究は予想以上に進むこととなった。これに加えて、やはり新型コロナウイルスのため研究打ち合わせや学会参加のための旅費支出がほとんどなく、結果としてかなりの次年度使用額が生じた。令和3年度では次年度使用額と当該年度に請求する助成金を合わせて、上記の推進方針に則ってRFX1を阻害、および活性化する小分子の探索と選定、そしてOAモデル動物を用いたin vivoでの効果検証へと研究を進めていく予定である。
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