| 研究課題/領域番号 |
20K18923
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| 研究機関 | 富山県衛生研究所 |
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研究代表者 |
安川 和志 富山県衛生研究所, 化学部, 主任研究員 (00737835)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | 遺伝子型別 / 三重鎖DNA / レジオネラ属菌 / 病原性細菌 |
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| 研究実績の概要 |
細菌感染による食中毒や感染症等の発生時には、「起因菌の同定」と共に「菌株の型別」を実施する必要がある。本研究は、微生物の染色体DNA上に存在するポリプリン-ポリピリミジン（PolyR）配列情報を利用した遺伝子型別方法論の確立と簡便で迅速な検査法への応用を目的としている。
令和４年度は以下の実験を実施した。
迅速かつ簡便なPolyR配列の検出を目的に、対象とするPolyR配列の三重鎖DNA形成をトリガーとしたローリングサークル増幅(RCA)反応の検討をした。
本反応は4つの段階から成り、1) 対象とするPolyR配列に対して選択的に三重鎖DNAを形成するモレキュラービーコン(MB)を用いて、三重鎖DNAを形成する段階と2) 三重鎖DNA構造の形成によりヘアピン構造が開いたMBの3’末端側と環状一本鎖DNA（増幅産物にG4構造を形成するようにデザインした）の配列特異的なアニーリングの段階、3) MBとアニーリングした環状一本鎖DNAのRCA反応によるG4構造の増幅段階、そして4)RCA反応によって生じたG4構造をチオフラビンTの存在下で蛍光検出する段階からなる。
まず初めに、4段階の反応をone-pot反応で実施した。しかしながら、三重鎖DNAの形成条件では、RCA反応に利用するポリメラーゼ活性の著しい低下が確認された。そこで、4段階の反応を段階的に実施することでこの問題点を検討した。結果として、1)、2)の段階を三重鎖DNA形成条件で反応後、4倍希釈した反応液を3)のRCA反応に使用することで、生成したG4構造とチオフラビンTとの結合による蛍光を確認した。しかし、1)、2)の段階の反応液を希釈してRCA反応に供するため、増幅時間を長くして感度を上げる必要があり、そのことがバックグラウンドの増加によるS/N比の低下につながった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の予定通り、染色体DNA上に存在するPolyR配列を三重鎖DNAの形成をトリガーとしたローリングサークル増幅 (RCA) 反応の検討を実施した。しかし、RCA反応に利用する純度の高い一本鎖環状DNAの作成に時間を要した。また令和４年度は行政検査等に多くの時間を要したため研究業務に十分な時間を確保できず、十分な検討ができなかった。
以上の点から、やや遅れていると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度に引き続き、染色体DNA上に存在するPolyR配列を三重鎖DNAの形成をトリガーとしたローリングサークル増幅反応の検討を実施する。研究期間内に得られた知見を論文にまとめ広く周知する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究活動に必要な活動時間を確保できなかった。また、研究の進捗の遅れにより予定していた論文の投稿を実施できなかった。
今後、三重鎖DNA形成領域の検出系構築に利用する。
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