| 研究課題/領域番号 |
20K18924
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| 研究機関 | 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所 |
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研究代表者 |
白井 達哉 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所, 微生物部, 研究員 (30846473)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ノロウイルス / RdRp / 遺伝子変異 |
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| 研究実績の概要 |
2020年度に作製したノロウイルス（NV）の遺伝子全長（GII.4[P31]）を挿入した哺乳類発現ベクターをHEK293FＴ細胞へトランスフェクションした。RNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）が発現しRNAの複製が行われているかを確認するために以下のような実験を行った。
（1）Capsid構成タンパクVP1の検出：RdRpはNV遺伝子の一部をsubgenomic RNA(sgRNA)として複製し、VP1はsgRNAから翻訳される。市販のポリクローナル抗体を用いてWestern blottingを行ったが、VP1は検出されなかった。
（2）抗RdRpポリクローナル抗体の作製： Infusion-cloning法により大腸菌発現ベクターpET-28aにRdRpをコードする配列（His×6末端）を導入した。RdRpタンパク発現及び抗体作出は株式会社バイオロジカに委託した。抗体が入手出来たらWestern blottingなどによりRdRpの検出を試みる。
（3）Real-time RT-PCRによるNV RNA検出：トランスフェクション後24~72時間の細胞からTotal RNAを抽出し、NV GIIを検出するReal-time RT-PCR（Primer：COG2F/COG2R、Probe：RING2AL-TP（「国立感染症研究所 病原体検出マニュアル ノロウイルス令和元年6月」））に供した。このとき、サンプルにはベクターDNAが残存しているため、逆転写酵素を含まない反応チューブを用意し、比較することでRNA量を推察した。結果として、24~48時間に採取したサンプルでノロウイルスRNAが検出された。ただし、導入したベクターからRNAが転写される過程は宿主細胞由来RNAポリメラーゼにより行われるため、RdRpによるRNAの複製が行われているかは更なる検証が必要である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究計画調書に照らし合わせると、2021年度からRNA複製実験と核酸解析（シークエンス）を開始するとしている。新型コロナウイルス検査及びその次世代シークエンス解析を業務としていることで時間的な制約も発生し、核酸解析に着手できていないため上記の区分とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
哺乳類発現ベクターをトランスフェクションにより哺乳類細胞に導入し、RdRpが発現しているかWestern blottingなどにより確認する。また、細胞から抽出したRNAに対しNorthern blottingを行い、subgenomic RNAを検出することでRdRpによるRNA複製が行われていることを確認する。ここまで確認できたら、次世代シークエンスによりRNAの配列解析を行う。NV遺伝子全長を組み込んだベクターからのRdRp発現が難しい場合は、RdRpのみを発現するベクターを別途導入し、発現させる。哺乳類細胞から得られる情報だけで不十分な場合は、全長RNAに対して精製RdRpタンパクにより複製を試験管内で行い、その配列を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究所ではウイルス遺伝子を対象とする研究テーマを複数有しており、今年度に実施したPCR、クローニング及び培養等に関して、試薬や物品の一部を試薬や物品を他の研究と共用するなどして無駄をなくし、コストを抑える工夫ができた。また、情報収集のために参加予定であった学会がWeb開催になるなどして、旅費が発生しなかった。次年度の使用計画としては、（1）トランスフェクションやそれに用いるベクター、細胞の検討、（2）たん白質の発現確認に用いる抗体の作製、購入、（3）RNA変異解析のためのシークエンス解析等を充実したものにするために利用する。
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