| 研究課題/領域番号 |
20K19567
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| 研究機関 | 電気通信大学 |
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研究代表者 |
田中 嘉法 電気通信大学, 大学院情報理工学研究科, 研究員 (40791249)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 骨格筋 / 乳酸 / In vivoイメージング / 筋疲労 |
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| 研究実績の概要 |
近年では，代謝産物の一つである「乳酸」は筋疲労時に疲労を助長するのではなく，疲労の軽減に寄与していると考えられるようになってきた．そこで，細胞内の乳酸塩を可視化することにより，乳酸が持久的収縮中に生じる筋発揮張力の低下を抑制する機構を解明することを目指している．まず，乳酸塩を可視化するために，乳酸塩に反応する蛍光タンパク質をラットの筋に発現させるモデルを作成し，本モデルで細胞内の乳酸塩を観察することが出来ることを確認した．その後，乳酸塩が疲労の軽減に寄与しているのかを検証するために，本モデルを用いて持久的な筋収縮を負荷した際の細胞内乳酸塩動態及び，筋発揮張力の変化を検証した．その結果，細胞外高乳酸濃度環境下では，細胞内の乳酸濃度が上昇し，筋発揮張力の低下が有意に抑制されることが示された．
細胞外高乳酸濃度環境下において，持久的な筋収縮を負荷した際有意に筋発揮張力の低下が防がれることから，どのように乳酸塩が筋発揮張力の低下を抑制しているのかを検証した．本研究では，Nielsen et al., (2001) が，乳酸塩が細胞膜の膜電位に作用し，膜電位の興奮性を維持することを示していることから，乳酸負荷実験では，乳酸塩が細胞膜に作用し，筋発揮張力を維持させると考えた．そこで，乳酸が膜電位の興奮性維持に寄与しているのかを検証するために，乳酸を負荷し，持久性収縮を施した際の筋電図動態を測定した．その結果，20 mMのL-乳酸塩を負荷した際，膜興奮性の指標として測定した筋電図の振幅の低下が遅延することが示された．以上のことから，細胞外の高濃度乳酸は，筋線維の膜電位の興奮性の維持に寄与することで，持続的な張力発揮の維持に貢献する可能性を示した．この実験結果は，2020年9月に行われた日本体力医学会で発表を行った．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度においては，「in vivo環境下での乳酸観察モデルの確立」，「細胞外乳酸高濃度条件下での持久的な筋収縮中の筋細胞内乳酸動態の観察」及び，「細胞外高乳酸濃度環境下での乳酸と筋電図の関係」の3つの研究課題に取り組んだ．
In vivo環境下での乳酸観察モデルの確立においては，エレクトロポレーションを用いた電気穿孔法を用いて，ラット骨格筋に乳酸感受性蛍光タンパク質を導入し，蛍光タンパク質が発現したラットモデルを用いて細胞内の乳酸塩が観察可能であるのかを検証した．その結果，本モデルにおいて乳酸塩の観察が可能であることが確認された．しかしながら，筋線維全体に対する蛍光タンパク質発現線維が少ないことや，電気による筋損傷が観察されることなどを踏まえ，更なる改良が必要であると考えられる．本モデルを用いて，細胞外高乳酸濃度条件下で持久的な筋収縮を負荷した際の細胞内乳酸濃度の観察及び，筋発揮張力変化を検証した．その結果，20 mMのL-乳酸塩を負荷した際に，12±2%の細胞内乳酸濃度の上昇が観察され，それは，観察終了時まで維持された．また，この時の筋発揮張力は，乳酸を負荷していない群と比較して，有意に筋発揮張力の低下が抑制された．また，同条件下で筋電図を測定し，乳酸塩が細胞膜に作用し，膜興奮性を維持するのかを検証した．その結果，20 mMのL-乳酸塩を負荷した群では，膜興奮性の指標として設定した筋電図の振幅の低下が，乳酸塩を負荷していない群と比較して，遅延した．このことから，乳酸塩は，膜興奮性を維持させることで，筋発揮張力の低下を抑制している可能性が示された．
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度においては，3つの研究課題に取り組んだものの，それぞれにおいて課題が残ったため，課題の解決に努めていく．
まず，「in vivo環境下での乳酸観察モデルの確立」においては，筋線維全体に対する蛍光タンパク質発現線維が少ないことや，電気による筋損傷が観察されることが問題として挙げられた．この問題を解決するために，プロテアーゼを蛍光タンパク質を導入する前に導入することが考えられる．先行研究においても，プロテアーゼを使用した例も多い．そのため，筋自体に与える影響を考慮しながら，使用を検討したい．また，「細胞外乳酸高濃度条件下での持久的な筋収縮中の筋細胞内乳酸動態の観察」及び，「細胞外高乳酸濃度環境下での乳酸と筋電図の関係」においては，乳酸塩が細胞内に取り込まれるのか，もしくは取り込まれなくとも効果があるのかを検証する必要性が確認された．そのため，申請書においても記述してあるように，乳酸を細胞内に取り込むとされているモノカルボン酸輸送体 (MCT) を阻害した時の動態や，L-乳酸塩と構造は同じものの，細胞内に取り込まれづらい光学異性体であるD-乳酸塩を用いることで，乳酸塩が筋発揮張力の低下抑制に及ぼす機序を解明する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度においては，エレクトロポレーターを購入するための予算を計上していた．しかしながら，研究代表者が所属する研究室において，エレクトロポレーターを貸し出して頂けるようになったため，エレクトロポレーターを購入しなかった．また，コロナ禍において，学会がオンラインで行われたため，旅費の出費がなかった．
本年度においては，エレクトロポレーターの購入の必要性がなくなったため，乳酸観察の精度を向上するために，蛍光観察システムの性能向上に予算を使用する予定である．また，その他に実験動物及び実験に使用する薬品を購入する予定である．また，旅費においても，本年度は現地での開催が予定されているため，旅費を使用し，学会に参加する予定である．
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