| 研究課題/領域番号 |
20K19719
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
坂上 弘明 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (80734855)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | D-アミノ酸 / 皮膚バリア機能 / フィラグリン / ショットガンプロテオミクス |
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| 研究実績の概要 |
皮膚は体の最も外側を覆う人体最大の臓器であり、腸内と同様にマイクロバイオームを形成している。100種類を超える細菌が存在しているうち、代表的な細菌として、表皮ブドウ球菌、アクネ桿菌、黄色ブドウ球菌が挙げられる。これまでの検討で、アクネ桿菌の培養上清中のD-アミノ酸を分析したところ、D-アラニンの存在が確認された。本研究では、皮膚常在菌より産生・分泌されるD-アミノ酸の皮膚に対する作用について検討している。
昨年度は不死化ヒト表皮角化細胞株であるHaCaTに対して、D-アミノ酸、およびフィラグリンの発現促進が認められているラクトフェリンやLPAを作用させたものの、フィラグリン産生促進作用が認められなかった。一般的に、正常ヒト表皮角化細胞（NHEK）ではカルシウム濃度が1 mMを超えると分化が誘導され増殖能を失うとされているが、HaCaTでは1 mMカルシウム存在下でも増殖するとともに、薬液処置なしで分化マーカーであるケラチン10の遺伝子発現も増加していたことから、HaCaTを用いて分化を評価・解釈することは困難であると考え、NHEKを用いて検討することとした。
また、本年度より産業技術総合研究所へ研究拠点を移し、高感度質量分析計が使用可能となったため、タンパク質の発現解析をRT-PCRからショットガンプロテオミクスへと変更することとした。本年度はショットガンプロテオミクスを行うための基礎的な検討とNHEKの培養を行い、分析用プロトコルを確立した。詳しいタンパク質の発現情報は得られていないものの、HaCaTと異なりNHEKでは1 mMのカルシウムの添加により形態の変化、増殖の停止がみられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
解析手法がRT-PCRからショットガンプロテオミクスへ変わったことにより、一度に多種類のタンパク質の増減が解析できるようになった。本年度、ショットガンプロテオミクスを行うための基礎的な検討を完了できたことから、前年度の遅れを少し取り戻すことができたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に確立したショットガンプロテオミクスにより、Ｄ-アミノ酸の処理により変動するタンパク質を網羅的に解析する。また、研究拠点の変更により、遊離Ｄ-アミノ酸解析が行えない状況であるため、当研究所の質量分析計に適した遊離Ｄ-アミノ酸解析技術を構築する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
解析手法をRT-PCRからショットガンプロテオミクスへ変更し、昨年度は基礎的研究にとどまったため、予算にあまりが生じた。本年度は、細胞培養、分析、解析がメインとなるため、細胞培養費用、分析カラムや溶媒、プラスチック製品に使用される。
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