2020 年度実施状況報告書

放射線による炎症反応が引き起こす組織微小環境の変化は、乳腺の発がんに影響するか？

研究課題

研究課題/領域番号	20K19970
研究機関	国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構
研究代表者	永田健斗国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 放射線医学総合研究所放射線影響研究部, 博士研究員(任常) (00867236)
研究期間 (年度)	2020-04-01 – 2023-03-31
キーワード	ラット / 放射線 / 発がん / 乳腺 / 組織微小環境
研究実績の概要	哺乳類のモデル生物であるラットでは、放射線により乳がんが誘導される。発がんメカニズムの解明のため、乳腺細胞の放射線応答、とくにDNA損傷を起因とした発がんを想定した研究がなされている。一方で、炎症等の組織微小環境の変化によって発がんが誘導される。例えば、放射線により誘導された炎症反応は発がんを促すが、ラット乳腺における発がんと炎症反応の関与は未解明な部分が多い。ラット乳がんの発生リスクは低線量率放射線の影響が高線量率よりも低くなることが報告されている。本研究ではその原因を炎症反応等の組織微小環境の面から解明することを目的とする。まず、先行研究で得られている発がんリスクの線量率依存性を炎症反応にて説明するため、2種の線量率（高線量率、低線量率）の放射線をラット雌成体に照射した。放射線照射後、SPF環境下において飼育を継続し経過観察 (行動、健康状況) を詳細に実施し、一定期間飼育後に乳腺組織をサンプリングした。さらに、炎症細胞の分布と乳腺構造の関係性を検討すべく、3次元の病理組織学的手法によりラット乳腺組織を丸ごと免疫染色する方法を検討した。組織をサンプリングする際の固定法を検討し、ラット乳腺組織に最適な固定法を定めた。適切な固定法により化学固定した乳腺組織を電気泳動法により脱脂させた後、乳腺細胞の基底細胞マーカーである抗体を使用して組織丸ごと免疫染色を行った。その結果、乳管や腺房といった乳腺構造を可視化することに成功し、乳腺構造を丸ごと観察する系を樹立した。今後は、この手法を応用する形で、炎症反応を含めた組織微小環境の変化を確認する。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由今年度は所属機関における放射線照射実験（動物実験）を実施し、複数の線量率条件および照射後から解剖までの期間を複数設定した動物サンプルを準備した。解剖の際に採材したラット乳腺組織は、ホールマウント標本としてホルマリン固定または4%パラホルムアルデヒドによる化学固定を実施した。ホルマリン固定サンプルについては、パラフィン包埋後に薄切を実施した。ヘマトキシリン・エオジン染色により平面上でラット乳腺組織の構造を把握、さらには抗体染色により乳腺組織の基底細胞、内腔細胞の識別する手法を確立した。ラット乳腺組織を立体のまま観察する手法を確立することを目指し、透明化組織標本の作製について検討した。4％パラホルムアルデヒドによる化学固定をしたラット乳腺組織を用いた抗体染色条件の検討を行った。一次抗体として乳腺の基底細胞および内腔細胞のマーカーであるサイトケラチン抗体を、二次抗体として蛍光標識抗体を使用した。乳腺構造を立体的に観察するため共焦点顕微鏡により組織丸ごと観察をした。その結果、上記抗体を使用した方法で、複雑な乳腺構造を抗体染色法によって明らかにすることに成功した。そのため、進捗状況としては概ね順調に進展していると判断した。
今後の研究の推進方策	今年度の研究では、昨年度に放射線照射し、化学固定まで実施した動物サンプルを用いて、ラット乳腺構造の把握に必要な抗体の選別（基底細胞マーカー、内腔細胞マーカー）を行う。また、ラット乳腺組織における炎症系反応および放射線応答に特異的な抗体を評価するため、透明化標本による検討の前にパラフィン切片を作製し実験条件（抗体反応条件）を検討する。放射線に被ばくした乳腺組織の間質細胞における炎症反応の分布を立体的に評価するために、透明化したラット乳腺組織における免疫染色後に、共焦点顕微鏡等を用いた立体的な撮像を行い、三次元データの取得を行う。画像解析ソフトウェアを使用して、ラット乳腺組織における炎症細胞、DNA損傷等の放射線応答の定量的評価を行い、線量率による反応の相違を検討する。
次年度使用額が生じた理由	今年度は、新型コロナウイルス感染症拡大により、各種国内学会への現地参加が困難となり、旅費（交通費）に関わる部分を支出しなかった。さらに、緊急事態宣言に伴う、動物飼育数の制限等により、当初想定していた動物飼育に関わる支出を抑えていた。次年度は計画的に学会参加を行うほか、次年度使用額を動物実験関係の消耗品購入費等に充てることを計画している。