| 研究課題/領域番号 |
20K20180
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
牧 功一郎 京都大学, 医生物学研究所, 助教 (90849233)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | バイオメカニクス / 生体医工学 / ＤＮＡ / 遺伝子転写 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，力学環境における遺伝子転写メカニズムの理解を目指し，クロマチンの力学動態の解明を目的としている．細胞核内においては，二本鎖DNAが解離することにより遺伝子転写・複製が進行する．その際に生じた一本鎖DNAは，種々のタンパク質と核内構造体を形成することにより，クロマチンを介した力感知，ひいては，力学環境における幹細胞分化過程に寄与する可能性が示唆されている．しかしながら，一本鎖DNAを核内で可視化する手法は未だ提案されておらず，その動態については不明な点が多い．本研究では，一本鎖DNAの細胞核内分布を明らかにすることを目的としている．はじめに，本実験手法の妥当性を検討した結果，核内の一本鎖DNAが特異的に検出されることが示された．さらに，本手法に基づき，一本鎖DNA と核小体マーカーの共染色を行った結果，一本鎖DNAが核小体近傍において凝集体を形成する新しいメカニズムの可能性を見出した．今後は，核小体近傍に生じた一本鎖DNAの凝集体の生理的機能・力学的な形成メカニズムについて検討を進める予定である．一本鎖DNA凝集体の機能性を検証するため，原子間力顕微鏡・超解像顕微鏡・電子顕微鏡を援用した詳細な構造観察，および，核小体近傍の一本鎖DNAに対するシーケンシングを行う．さらに，その形成メカニズムを探るため，細胞外からの力学的摂動実験も進める．以上の取り組みを通じて，本研究で発展させた新規イメージング技術により明らかとなった一本鎖DNAの細胞内ダイナミクスの力学的理解を目指す．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
これまでに，細胞核内における一本鎖DNAの新規イメージング手法の評価を行った．一本鎖DNAとヘテロクロマチンの共染色を行った結果，一本鎖DNAがユークロマチン領域において特徴的な分布を示すことが明らかとなった．本手法で観察された一本鎖DNAの蛍光シグナルは，S1 Nucleaseによる一本鎖DNAの特異的分解により消失した．これらの結果から，核内の一本鎖DNAが特異的に検出されることが示された．さらに，本手法に基づき，一本鎖DNA と核小体マーカーの共染色を行った結果，一本鎖DNAが核小体近傍において凝集体を形成することを見出した．
本研究により，一本鎖DNAの細胞核内分布について重要な知見が得られており，現在，論文の投稿準備を進めていることから，当初の計画以上に進展していると判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は，核小体近傍に生じた一本鎖DNAの凝集体の生理的機能・力学的な形成メカニズムについて検討を進める予定である．一本鎖DNA凝集体の機能性を検証するため，原子間力顕微鏡・超解像顕微鏡・電子顕微鏡を援用した詳細な構造観察，および，核小体近傍の一本鎖DNAに対するシーケンシングを行う．さらに，その形成メカニズムを探るため，細胞外からの力学的摂動実験も進める．事前検討において，浸透圧負荷にともなう一本鎖DNA凝集体の消失がすでに観察されており，今後は，浸透圧の正確な計測とリアルタイム観察によって，一本鎖DNAが核小体の近傍で凝集するメカニズムを検証する．以上の取り組みを通じて，本研究で発展させた新規イメージング技術により明らかとなった一本鎖DNAの細胞内ダイナミクスの力学的理解を目指す．
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