| 研究課題/領域番号 |
17H06242
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
石井 則行 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10261174)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2021-03-31
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| キーワード | 生体分子 / 膜小胞 / エキソソーム / エクソソーム / 電子顕微鏡 / ナノコロイド |
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| 研究実績の概要 |
細胞外膜小胞は、すべての細胞から放出される小胞であり、エキソソームやマイクロベシクル、さらに不均質な粒子群を含み、正常な発生や生理的プロセスならびに全身の病理的プロセスに関与し、局所および遠方の微小環境において細胞間情報伝達を担っている。エキソソームがナノコロイド粒子であることに留意し、物理化学的視点に立った解析を進めた。具体的には、がん細胞や疾病モデル等の種類の異なった細胞株の培養上清に我々の開発した分画調製法を適用し、当該調製法の一般化、高度化を進めると共に、ショ糖密度勾配超遠心分画の各画分について、免疫生化学分析、動的光散乱（DLS）法によるナノ粒子径計測、電子顕微鏡解析等を実施した。細胞種は、PC12、NG1O8-15、C6Bu-1、N18TG-2、SH-SY5Y、SK-N-SH、NIH/3T3、COS7、HCT116、HEK293を用いた。
我々の開発した新規調製法により分画したHEK293由来のCD63陽性膜小胞画分ついて、試行的にＸ線溶液散乱（SAXS）実験を行い、脂質膜の構造が反映される高q領域の解析を行った。また、DLS計測や電子顕微鏡解析から、各画分の小胞の構成比は必ずしも均質とは言えないが、HEK293やC6Bu-1由来の膜小胞画分について、平均的ゼータ電位を計測し、興味深い荷電状態が確認された。
エキソソームは、多様性に富む生体由来のナノスケールの複雑系であり、その生物物理学的解析には、クライオ電子顕微鏡法によるアプローチは最適と考えている。近年、クライオ電子顕微鏡解析に起きた飛躍的な技術革新について、ハード、ソフト両面から調査・分析等を行い、今後、本課題を遂行する上で有益な連携基盤の構築を進めた。引き続き、クライオ電子顕微鏡解析をも視野に入れ、形体、粒径とその分布様式、荷電（ゼータ電位）等のデータを集積し、物理化学的特性の全容解明を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
国内外で広く知られている標準的プロトコールに沿って調製されたエキソソーム群は、何れも100 nm付近に単一ピークをもつガウス様の粒径分布を示す。ところが、近年報告された細胞超薄切片の電子顕微鏡観察によると、細胞から分泌される直前のマルチベシキュラーボディー（MVB）中や、分泌直後のエキソソームは、粒径約50 nmであるらしい。我々の開発した分離調製法によるエキソソーム画分の電子顕微鏡解析や、金ナノ粒子で標識した免疫電子顕微鏡法による解析は、これを支持する結果であった。このことは、従来法（現行法）により調製された膜小胞は、分泌直後の状態（形状や性質等）を保持していない、すなわち、変性（凝集や融合等）している可能性を強く示唆しており、我々の開発した調製法の優位性を示している。これらを含めて検証を進めており、「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、エキソソームに代表される細胞外膜小胞がナノスケールのコロイド粒子であることに留意し、所内外の研究協力者の支援を得て、コロイド化学、ナノ物性、量子力学等、物理化学的基盤に立った解析を進めている。産総研において開発した「生物物理学的解析に適した膜小胞の調製方法」(特願第2016-075498号、PCT/JP2017/013999)を共通基盤技術として活用し、種類の異なる細胞株(疾患モデル細胞等)の培養上清に適用し、生育条件等の影響を検証すると共に、当該調製法の一般化、更なる高度化について検討を進める。
本研究助成により整備できた動的光散乱(DLS)法によるナノ粒子径計測システム等をフル活用し、エキソソームの分離・調製条件の最適化および評価手法の確立を急ぐ。具体的には、ショ糖密度勾配超遠心分画からの各画分についてDLS法によるナノ粒子径計測および粒子径分布解析と、電子顕微鏡法による解析データとの整合性を精査する。さらに、前例のないナノスケール領域(100 nm近傍)における分離手法に新たなアイディアを試行し、粒子径指標による画分の均質化に挑戦する。
引き続き、電子顕微鏡解析に有用な要素技術開発を進め、クライオ電子顕微鏡法による膜小胞の形態、三次元構成を探究する。種々の細胞種に由来する膜小胞(エキソソーム等)の形状、粒径および分布様式、荷電(ゼータ電位)等の物理化学測定を進め、“真正な”エキソソームに特徴的な生物物理化学的特性の解析を急ぐ。がん等の難治性疾患の早期診断を可能とする疾患・病態バイオマーカーや非侵襲的早期診断技術開発に役立つ簡便かつ迅速な計測手法ならびに多様な成分と性質から成るエキソソームの規格分類化の基盤となる要素技術の開発へと進める。
我々の調製方法による“真正な”細胞外膜小胞(エキソソーム等)について得られた成果は順次、論文誌や学会等で発表して行く。
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