| 研究課題/領域番号 |
17H06242
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
石井 則行 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10261174)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2021-03-31
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| キーワード | エクソソーム / エキソソーム / 生体分子 / 細胞外膜小胞 / ナノコロイド / 透過型電子顕微鏡 / 動的光散乱 |
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| 研究実績の概要 |
エキソソーム（exosome）は、細胞内の小胞輸送系を介して後期エンドソーム区画の多胞体（MVB：multivesicular body）から細胞外に放出される細胞外小胞（EV：extracellular vesicle）の一種であり、血液・唾液等の体液循環に乗って隣接もしくは離れた組織・細胞に取り込まれ、細胞間情報伝達ツールとして機能している。
エキソソームがナノコロイド粒子であることに留意し、細胞から分泌された直後の物理化学的特性を担持した“インタクト”なエキソソームの調製方法の開発・確立にフォーカスし、理工学的基盤に立脚した物理化学的評価基準から調製条件の適正化を進めた。具体的には、ヒト胎児腎細胞293（HEK-293）の培養上清からショ糖密度勾配超遠心分離法を基軸に分画調製し、テトラスパニンCD63等を指標に免疫生化学的にエキソソーム含有分画の同定、免疫電子顕微鏡法による形状評価、相互に動作原理を異にする動的光散乱法と電子顕微鏡解析から粒径計測および粒径分布様式について比較検討等を行った。また、荷電状態（ゼータ電位）に着目し、新規分画調製法を試行した。併行してクライオ電子顕微鏡解析に適した“インタクト”なエキソソームの調製を可能とする前処理手技を試行的に検討し、エキソソームの構造・形態安定に寄与する種々のパラメータに関して貴重な知見を得ることができた。
従来、エキソソームの粒径分布は～100 nmにピークをもつ単純なガウス分布として示されているが、本調製技術による“インタクト”なエキソソームでは、粒径～50 nmの集団も確認された。HEK-293細胞を脱水処理、樹脂包埋したブロックから超薄切片を切り出し、電子顕微鏡解析からMVB内のエキソソームの粒径を評価したところ、68.7 ± 16.6 nmであることが分かり、高い整合性が認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
エキソソームは、ほぼすべての真核細胞の後期エンドソーム区画で産生される細胞膜結合性の分泌膜小胞であり、体液循環に乗って他の組織・細胞へと運ばれ、発生、生理、病理的プロセスにおいて細胞間情報伝達ツールとして機能している。癌の臓器特異的転移にも関与しており、その標的分子認識機構の解明は、革新的ドラッグデリバリー技術開発を加速する。
一方で、エキソソームは、ナノサイズのヘテロな複雑系であり、標準化された調製方法は確立されておらず、物理化学的特性を担持した調製方法に至っては皆無といえる。「玉石混淆」等々、多くの技術的課題を抱えている。エキソソームはナノコロイド粒子であり、細胞から分泌直後の性質を保持した状態にある“インタクト”なエキソソームの調製方法の開発・確立を目指し、理工学的基盤に立脚した物理化学的評価基準から調製条件の適正化を進めた。ヒト胎児腎細胞293（HEK-293）の培養上清からショ糖密度勾配超遠心分離法を基軸に分画調製し、テトラスパニンCD63等を指標に免疫生化学的にエキソソーム含有分画の同定、免疫電子顕微鏡法による形状評価、相互に動作原理を異にする動的光散乱法と電子顕微鏡解析から粒径計測および粒子径分布様式の比較検討等を行い、併行して荷電状態（ゼータ電位）に着目した新規考案の調製法を試行した。クライオ電子顕微鏡解析に適した“インタクト”なエキソソーム調製について前処理条件を検討し、エキソソームの構造・形態安定に寄与する種々のパラメータに関して貴重な知見が得られた。また、HEK-293細胞の超薄切片を対象とした電子顕微鏡解析から“インタクト”なエキソソームの粒子径に関して有益な知見を得ることができた。その過程で電子顕微鏡観察に有効な「電顕観察試料作製用工具」等を考案し特許出願することができた。これらを客観的に総合評価し、「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
広く一般に用いられているエキソソーム調製法によって“精製”されたエキソソームを、電子顕微鏡法により直接観察、評価したところ、多分に凝集・融合変性しており、細胞から分泌直後の形状や物理化学的性質を反映していないことを見出している。この課題を克服し、「生物物理学的解析に適した膜小胞の調製方法」(PCT/JP2017/013999、特願2018-510600)として、電子顕微鏡解析等の生物物理学、物理化学的解析に適したエキソソーム調製法を開発した。本技術が、エキソソーム研究において共通基盤技術として広く普及することが極めて重要と考えている。
本方法で得られたエキソソーム分画は、生化学的解析のみならず物理化学的解析や電子顕微鏡解析等の多様な原理に基づく解析法に対して迅速かつ容易に適用可能であり、以下の特徴を有している；①分泌直後の形状と物理化学的性質を保持したエキソソーム調製が可能、②電子顕微鏡解析等の生物物理化学的解析や細胞生物学的分析を迅速かつ容易に実施可能、③動的光散乱解析と電子顕微鏡解析データ間で整合性の取れた粒径解析が実施可能、④エキソソーム構成成分の存否、変動等を高感度に解析可能。
今後は、エキソソームを分画調製する過程で、クライオ電子顕微鏡解析に適した調製条件、前処理手法について検討を進め、適宜、独自に電子顕微鏡法の要素技術を考案し、クライオ電子顕微鏡法により“インタクトな”エキソソームに特徴的な生物物理化学的特性の解明を急ぐ。
理工学的基盤に立脚したエキソソーム解析は重要であり、理工学からの基礎医学的知見の充足は今後必要かつ有用となる。エキソソームがナノコロイド粒子であることに留意し、所内外の研究者と連携して、生物物理学、物理化学的基盤からの解析を進める。“インタクトな”細胞外膜小胞（エキソソーム等）について得られた成果は順次、論文誌や学会等で発表して行く。
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