| 研究課題/領域番号 |
17H06249
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 宮崎大学 |
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研究代表者 |
酒井 正博 宮崎大学, 農学部, 教授 (20178536)
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| 研究分担者 |
稲田 真理 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 研究員 (50723558)
引間 順一 宮崎大学, 農学部, 准教授 (70708130)
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| 研究期間 (年度) |
2017-06-30 – 2022-03-31
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| キーワード | エビ類 / 細胞培養 / ウイルス疾病 / 細胞増殖因子 |
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| 研究実績の概要 |
細胞の機能解析やウイルスの研究を行うにあたり株化細胞の存在は重要である。1980 年代中頃からエビ類においても長期培養可能な細胞株の樹立が試みられてきたが、未だ実現していない。本研究は、これまで試みが行われなかったエビ類の細胞の長期培養に最適なサプリメントの作製から、ヒトの株化細胞作製過程で使用されている技術を取り入れてクルマエビの細胞を株化させるまでを体系立てて行い、長期間培養可能なエビ類の株化細胞を樹立することを目的としている。
30年度は、クルマエビのリンパ様器官を用いた初代培養に成功したが、１週間以上の細胞増殖が観察できていない。そこで、クルマエビのリンパ様器官由来の細胞が、初代培養を始めてから何日後から増殖率が低下するのかについて検討した。まず、生細胞に特異的に発現しているエステラーゼを蛍光染色するキットを用いて、生細胞と死細胞を区別し、その割合を蛍光顕微鏡をもちいて計測および算出した。さらに、生細胞と死細胞の割合が大きく変化する培養開始3日目から6日目の細胞を回収し、トランスクリプトーム解析用のサンプルとしてRNAを精製した。クルマエビは個体差が大きいため、その誤差を考慮して20匹以上のエビを初代培養に供して上記のサンプリングを行った。さらに、細胞増殖を誘導すると期待されるクルマエビの血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の組換えタンパク質を用いた細胞増殖への影響に関する実験は、令和元年度へ継続して実施する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度の報告書に示した実験計画にしたがって、次の実験を実施した。30年度は、クルマエビのリンパ様器官を用いた初代培養に成功したが、１週間以上の細胞増殖が観察できていない。そこで、クルマエビのリンパ様器官由来の細胞が、初代培養を始めてから何日後から増殖率が低下するのかについて検討した。まず、生細胞に特異的に発現しているエステラーゼを蛍光染色するキットを用いて、生細胞と死細胞を区別し、その割合を蛍光顕微鏡をもちいて計測および算出した。その結果、クルマエビのリンパ様器官由来の細胞は、培養開始3日目から4日目にかけて大きく生存率が低下した。そこで、生細胞と死細胞の割合が大きく変化する培養開始3日目から6日目の細胞を回収し、トランスクリプトーム解析用のサンプルとしてRNAを精製した。クルマエビは個体差が大きいため、その誤差を考慮して20匹以上のエビを初代培養に供して上記のサンプリングを行った。さらに、細胞増殖を誘導すると期待されるクルマエビVEGF組換えタンパク質を用いた細胞増殖への影響に関する実験は、令和元年度へ継続して実施する。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度の研究計画として、クルマエビのリンパ様器官由来の細胞が、一週間程度しか培養できない理由を解明するために、初代培養中に生細胞と死細胞の割合が大きく変化するタイミングに何か特別な遺伝子の発現パターンの変化があると考えた。そこで、クルマエビのリンパ様器官由来の細胞の初代培養において、生細胞と死細胞の割合が大きく変化する期間として、培養開始3日目から6日目の細胞に着目し、これらの細胞について次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を最初に行う。その結果を解析し、大きく発現動態が変化した遺伝子の探索を行う。また、細胞増殖を誘導すると期待されるクルマエビのVEGF組換えタンパク質を用いた細胞増殖への影響に関する実験は前年度から継続して実施する。
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