研究課題
29年度は、現在までに予備的実験で予想された異生物種HSF1の利用による熱ショック応答温度を変える方法のトランスジェニック動物での実証のための準備として、レシピエントであるメダカHSF1のKOを確立し、約10種の生物種のHSF1のインシリコクローニングを完了した。メダカHSF1-KOは共同研究先である熊本大学で作成し、表現型解析等を行い、胚性致死でなく生存可能、かつ、雄は生殖も可能であった。一方で雌は不妊となったが、これら表現系はマウスKOと同じであった。そして、熱ショック応答は組織特異的ではあるが、基本的に応答せず、ストレスに弱いことが分かった（投稿中）。30年度には、各HSF1をクローニングし、メダカHSF1-KOへ、トランスジェニックによるレスキューによる応答温度測定実験に移行する。また、それぞれのHSF1の3量体形成温度やHSE配列との温度依存的な結合特性解析を、組換えタンパク質で実施する。一方で、温度計測系では、共同研究先の大阪大学と共にgTEMPと名付けた蛍光タンパク質温度プローブを報告しているが、29年度は光毒性の少ない長波長域で励起が可能なverを開発し、培養細胞系への導入がほぼ完了した。赤外レーザー照射による温度変化を高速で観測できる顕微鏡の構築も進めた、赤外レーザー系以外のレシオメトリック温度計測用の分光装置とカメラによる高速ライトシート撮影までは完了した。30年度前半には赤外レーザー照射とそれによる新ver温度計測プローブによる撮影が可能となる見込みである。IR-LEGO顕微鏡法の応用として国際共同研究も実施し、熱ショック応答による遺伝子発現ではなく、単一細胞アブレーションによる神経細胞再生過程の解析を実施した。現在論文投稿中であるが、分子同定のための追加実験を計画中であり、査読状況によっては分子同定のデータを合わせた論文とすることも検討中である。
2: おおむね順調に進展している
本課題は2つのカテゴリーを同時並行で進める計画となっており、【A】生体構成要素（オルガネラ・細胞質・生体分子など）の熱的な物理特性の解析と、【B】生体分子（タンパク質、核酸）の熱・温度に対する物性の進化過程における変化の解析を計画している。まず、【A】については、細胞レベルでの熱的物性評価系として、温度計測プローブの開発と、高速温度イメージング顕微鏡の開発の2つが前提条件となる。本年度は備品としてW-View Gemini（顕微鏡イメージング用分光装置）を購入し、高速ライトシート顕微鏡（基礎生物学研究所野中准教授の協力）へ導入し、あとは赤外レーザー導入光学系の設置で完了予定となった（IRレーザーは別課題の競争的資金で購入済み）。また、温度計測プローブとして既に報告しているgTEMPは紫外光励起のため、生体への光毒性が懸念されるため、新たに長波長（500 nm付近）タイプの開発も大阪大学と共同研究を行い、実用タイプとして現在培養細胞への導入を行っている。このタイプに分光特性を合わせたフィルター類で上記W-Viewの光学系を構築している。以上から、【A】に関しては予定通り進捗しているといえる。【B】に関しては、HSF1をモデルに複数生物種において生息温度と、熱ショック応答温度の評価を、in vivoとin vitroで実施する予定であるが、in vivoの土台となるメダカHSF1-KO系統を樹立し、培養細胞系も立ち上げた。in vitro系では複数生物種の組換えタンパク質を使用するが、そのベースとなる配列はin silicoクローニングを完了できている。以上から【B】に関しても順調に進捗していると考えている。
現状の進捗は予定通り進んでいるため、30年度に特段の変更は考えていない。一方で、当初計画と異なる点としては、別件外部資金が採択となり、一部の研究機器（顕微鏡関連と、分子生物学的な機器類）のセットアップ等で、共通で使用できる装置を予定以上に揃えることができ、今後の計画での実験手技の幅が広がったので、必要に応じて新たな検証実験を加えることを考える。具体的には、高速細胞温度計測顕微鏡のリアルタイム演算のためのPCの購入ができたので当初計画では画像取得後に演算する予定であったが、リアルタイムで表示できるようにする。直接的には研究に直結しない部分であるが、30年度には第3回のバイオサーモロジーワークショップを当研究所で12月に開催する計画である。共同研究者や、関連分野の研究者と相談して講演者をすでに決定し、開催に向けて準備を進める。開催の予算は当研究所の共同利用課題として申請する予定である。このワークショップを通じて、本研究課題遂行に必要な情報交換や、共同研究を積極的に模索する。
すべて 2018 2017 その他
すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (6件) (うち国際共著 1件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (4件) (うち招待講演 1件) 備考 (1件)
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