2017 年度実績報告書

分泌蛋白質の拡散速度の時空間制御

研究課題

研究課題/領域番号	17H06259
配分区分	補助金
研究機関	国立研究開発法人理化学研究所
研究代表者	猪股秀彦国立研究開発法人理化学研究所, 多細胞システム形成研究センター, チームリーダー (60372166)
研究期間 (年度)	2017-06-30 – 2021-03-31
キーワード	モルフォゲン / 濃度勾配 / 時空間制御
研究実績の概要	本年度は、光依存的に拡散速度を制御するために３つのコンストラクト（人工レセプター、人工マトリックス、分泌蛋白質）の選定を行った。選定方法として培養細胞（COS7細胞）を用いて各々のコンストラクトが適切な領域に発現するコンストラクトを選択した。その後、得られたコンストラクトを用いてmRNAを合成し、ゼブラフィッシュ胚においても目的とする領域に発現するコンストラクトを選定した。人工レセプター及び人工マトリックスで共通して用いる分泌蛋白質に関しては、「SP（シグナルペプチド）・蛍光蛋白質（赤系）・バインダー」を基本構造として作製した。その結果、効率的に細胞外に分泌される分泌蛋白質の候補を得た。さらに、これらのコンストラクトをゼブラフィッシュ胚で発現させたところ、培養細胞だけでなく胚内においても効率的に分泌されるコンストラクトを複数得た。人工マトリックスに関しては、「SP（シグナルペプチド）・蛍光蛋白質（緑系）・光レセプター・HB（ヘパリン結合ドメイン）」を基本構造として作製した。また、蛍光蛋白質、光レセプター、HBの順序に関しては固定せず、いろいろな組み合わせでコンストラクトを作製した。その結果、培養細胞、ゼブラフィッシュ胚のいずれにおいても効率的に細胞外に分泌される複数の人工マトリックス候補を得た。人工レセプターに関しては、「SP（シグナルペプチド）・蛍光蛋白質（緑系）・光レセプター・TM（膜貫通ドメイン）」を基本構造として作製した。また、蛍光蛋白質、光レセプター、TMの順序に関しては固定せずに様々な組み合わせでコンストラクトを評価した。しかし、これまでに５０弱のコンストラクトを作製したが、その大部分は小胞体・ゴルジ体に蓄積し、効率的に細胞膜に移行するコンストラクトを得ることができなかった。今後は、細胞内ドメインに輸送シグナルを付加し細胞膜への移行を促進させる予定である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由本年度は、当初の予定通り培養細胞及びゼブラフィッシュ胚を用いてコンストラクトの選定を行った。その結果、人工マトリックス及び分泌蛋白質に関して複数の候補分子を作製することに成功した。一方、人工レセプターに関しては、現段階では効率的に細胞膜に移行するコンストラクトを作製できていない。この原因として、翻訳された蛋白質がゴルジ体及び小胞体で凝集体を形成している様子が観察された。これまでの研究から、チャネル蛋白質及びレセプターが膜上に効率よく局在するためには、Golgi exportシグナル・ER exportシグナルなどの輸送シグナルが重要であることが報告されている（Hofherr et al., 2005, J. Cell. Science）。実際に、これらのシグナルを付加することにより膜への局在が上昇することが報告されている。今後は、これらの輸送シグナルを人工レセプターに付加し、膜に効率よく局在する分子の選定を続ける必要がある。現在までの進捗状況としては、候補となる複数の分泌蛋白質及び人工マトリックスを作製することに成功しており、おおむね順調に進展していると考えている。
今後の研究の推進方策	今後は、複数の候補分子を得た人工マトリックスと分泌蛋白質に関しては、実際に光刺激依存的に両者間の結合を誘起できるか検証を行う。具体的には、ヘパリン結合ドメイン（HB）の付加により拡散速度が減速することを確認しているアフリカツメガエル胚、及びゼブラフィッシュ胚を用いて評価を行う。胚全体に人工マトリックスを発現させ、分泌蛋白質は胚の局所に発現させる予定である。このとき、分泌蛋白質を発現していない細胞間隙で局所に光刺激を与え、細胞間隙を拡散している分泌蛋白質が光刺激部位に集積する様子を観察する。この評価方法を用いて、これまでに得られた複数の候補分子の組み合わせを解析し、最も効率的に分泌蛋白質が集積する候補分子を選定する。人工レセプターに関しては、輸送シグナルを付加することにより効果的に膜上に移行する分子の選定を引き続き継続する。また、目的とする人工レセプターが得られた場合には人工マトリックスと同様に、光刺激依存的に分泌蛋白質が光刺激部位に集積する様子を観察する。これの実験により、実際に拡散速度を光制御する分子の選定を終える予定である。