| 研究課題/領域番号 |
18H05373
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
水口 裕之 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (50311387)
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| 研究分担者 |
仲瀬 裕志 札幌医科大学, 医学部, 教授 (60362498)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| キーワード | ヒト小腸オルガノイド / ヒト小腸吸収上皮細胞 / 分化 / 創薬 |
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| 研究実績の概要 |
小腸吸収上皮細胞は、様々な薬物代謝酵素や薬物トランスポーターを発現しているため、経口投与された薬物の吸収や排泄・代謝において重要な役割を担う。これまで、創薬研究において、医薬品候補化合物の小腸での吸収を評価するためのin vitro評価系としては、ヒト大腸癌細胞株であるCaco-2細胞を用いた系が汎用されてきた。しかしながら、Caco-2細胞はヒト小腸吸収上皮細胞に比べ、薬物代謝酵素や薬物トランスポーターの発現量が著しく低く、“吸収・排泄・代謝”を同時に評価できないという欠点を有していた。そこで本研究では、近年確立されたヒト腸オルガノイド培養技術を用いて、ヒト小腸オルガノイドから吸収上皮細胞への分化誘導技術の開発と、“吸収・代謝・排泄”を同時に評価できる新規in vitro評価系の開発を進める。H30年度は以下の成果を得た。
分担研究者の札幌医科大学仲瀬裕志教授と協力し、ヒト十二指腸生検サンプルより小腸オルガノイドを樹立した。このオルガノイドをトリプシン処理することによって得たシングルセルを、Matrigelコーティングしたトランズウェル上へ播種し、14日間の培養の末に単層膜を得た。膜抵抗値等を測定したところ十分なバリア形成能力を有していることを確認した。現在、5例分のヒト生検組織由来小腸オルガノイドの樹立に成功し、その継代・増幅・ストック化が進行中である。一方、コントロールとなるヒトiPS細胞由来腸管上皮細胞の高効率分化誘導法の改良も行い、villin 1陽性細胞率を指標に約95%の効率でヒトiPS細胞から腸管上皮細胞へ分化誘導することに成功し、ヒトiPS細胞由来腸管上皮細胞が薬物吸収・代謝試験に応用できる可能性を示した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
分担研究者の札幌医科大学仲瀬裕志教授と協力し、ヒト十二指腸生検サンプルより小腸オルガノイドを樹立した。具体的には、札幌医科大学附属病院にて同意を得た慢性胃炎および逆流性食道炎患者の上部内視鏡検査の際に、2-4片（6-12 g）の生検を採取した。4℃保存下で24時間以内にこの生検組織から、既報に則ってオルガノイドを樹立・継代した。このオルガノイドをトリプシン処理することによって得たシングルセルを、Matrigelコーティングしたトランズウェル上へ播種し、14日間の培養の末に単層膜を得た。作製した単層膜を形態学的に評価するため、位相差顕微鏡による観察、TEM（透過型電子顕微鏡）による観察、および膜抵抗値（TEER）の測定を行った。位相差顕微鏡による観察の結果、いずれの単層膜においても細胞同士の境界が明瞭な円柱上皮細胞様の形態がみられ、TEMによる観察では、腸管上皮細胞特有の微絨毛構造がみられた。膜抵抗値測定の結果、強固な単層膜であることも確認できた。現在、5例分のヒト生検組織由来小腸オルガノイドの樹立に成功し、その継代・増幅・ストック化が進行中である。
一方、コントロールとなるヒトiPS細胞由来腸管上皮細胞の分化誘導法の改良も行った。まず、内胚葉細胞から腸管前駆細胞への分化により適したGSK3β阻害剤、さらに腸管前駆細胞から腸管上皮細胞への分化を促進できる化合物あるいは液性因子の探索を行った。その結果、内胚葉細胞から腸管前駆細胞への分化にLY2090314を作用させ、腸管前駆細胞から腸管上皮細胞への分化には計7種のサイトカインや化合物を作用することでvillin 1陽性細胞率が約95%からなる分化誘導法の開発に成功した。さらに、本分化誘導法で作製した細胞がCYP3A4誘導試験やCES2代謝試験、傍細胞透過性基質の透過試験、PEPT1輸送試験に応用できる可能性を実証した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒト小腸オルガノイドから単層培養した吸収上皮細胞の機能を、ヒトiPS細胞由来腸管上皮細胞やCaco-2細胞と比較しながら詳細に検討する。具体的には以下について検討する。
（１）ヒト小腸吸収上皮細胞で発現する薬物代謝酵素は、約70%がCYP3A4であることが知られているため、CYP3A4の発現レベルの検討は最重要課題である。そこで、ヒト小腸オルガノイド由来吸収上皮細胞におけるCYP3A4の遺伝子発現とその活性（薬物代謝能）を評価する。また、小腸管腔側や小腸血管側に発現しているトランスポーター群の遺伝子発現を評価する。ヒト小腸オルガノイド由来吸収上皮細胞におけるCYP3A4や各種トランスポーターの発現について、Caco-2細胞やヒト小腸吸収上皮細胞（市販されているtotal RNAを使用）、本研究で作製するヒトiPS細胞由来小腸吸収上皮細胞と比較する。さらには、異なるドナーや、異なるクローン由来のヒト小腸オルガノイドから単層培養した吸収上皮細胞を作製し、その機能（CYP3A4やトランスポーター、各種小腸マーカー遺伝子の発現レベルや機能）についても解析する。
（２）ヒト小腸オルガノイドから単層培養した腸管上皮細胞における上記で解析した機能が不十分な場合には、単層培養後の基礎培地や細胞外マトリックスの最適化を行う。また必要に応じ、サイトカインや増殖因子、化合物のスクリーニングを行い、高機能なヒト小腸オルガノイド由来腸管上皮細胞の作製を試みる。また、ヒトiPS細胞由来腸管上皮細胞についても、更なる高機能化に向けて分化誘導法の改善に取り組む。
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