ペプチドによるドライアイの予防・治療薬の開発と臨床応用

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18H05386
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 星薬科大学
• 研究代表者: 塩田 清二 星薬科大学, 先端生命科学研究所, 教授 (80102375)
• 研究分担者: 竹ノ谷 文子 星薬科大学, 薬学部, 准教授 (30234412) ; 中町 智哉 富山大学, 大学院理工学研究部(理学), 講師 (30433840) ; 坪田 一男 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (40163878) ; 岩田 想 京都大学, 医学研究科, 教授 (60452330)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2022-03-31
• キーワード: PACAP / ドライアイ / 涙液分泌

研究実績の概要

PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide)は視床下部で産生され、神経伝達物質・修飾物質さらに免疫調節因子として作用する生理活性ペプチドである。申請者はPACAPによる神経新生・神経再生の分子制御機構を20年にわたりしらべてきた。最近我々は、ドライアイの発症にPACAPが直接関与する可能性を発見した（Nakamachi, Shiodaら、Nat Commun 2016）。すなわち、PACAP KOマウスでは涙液分泌の低下がおき、しかも高齢でメスのマウスに顕著に発症することも分かった。さらにこの動物個体では角膜上皮細胞の増殖により、血管新生および角膜障害が発症するなどのドライアイ様の表現型を有することも明らかになった。さらに、PACAPの動物個体への投与により涙液分泌の促進作用のあることや、ドライアイの動物個体にPACAPを投与すると治療効果のあることを明らかにした。つまり、PACAPのドライアイ治療薬としての可能性のあることも我々は明らかにした。当該研究では、既存のドライアイ点眼薬では機能がないといわれる角膜上皮・内皮細胞の再生・新生および抗炎症作用についてもPACAPの機能をしらべた結果、ヒト培養角膜上皮細胞に障害を加えたモデルにPACAPを添加すると角膜上皮細胞の再生と新生の起きることがはじめて明らかになった。また、PACAP点眼は２時間の持続的涙液分泌促進作用があることが分かったので、従来の点眼薬にない画期的な新規のドライアイの創薬開発ができると考えている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

まず、副交感神経ネットワークを介した PACAP の粘液分泌(涙液分泌)機構の解明を進めている。我々は、PACAP KOマウスを用いてPACAP 投与による涙液分泌促進作用をみているが、その生体内での分泌が副交感神経系と一致するかについて２重免疫組織化学法を用いて検索している。また交感神経・副交感神経の外科的および薬物投与による涙液分泌量の変化と PACAP との関連性をしらべている。さらにPACAP 投与後の涙腺からの涙液分泌の作用機序を動物実験にて調べている。次に、CRISPR-Cas9 システムを用いた PAC1R, VPAC1R,VPAC2R KO マウスの作出を行なっている。PACAPの受容体には上記の３種類が存在することから、涙液分泌に関与している受容体の種類の同定を行うために、各種受容体阻害剤を用いた動物実験と、受容体の遺伝子欠損マウスでのPACAP投与実験による涙液分泌促進作用についての実験を行なうことを目的として動物個体の作出を行なっている。PAC1R, VPAC1R, VPAC2R遺伝子のノックアウトマウスを作出するために、CRISPR/Cas9 システムを用いる。 さらに本研究では、PACAPの角膜創傷治癒作用の詳細を明らかにする為、その効果を分子レベルでしらべた。PACAPの角膜創傷治癒効果は、ヒト角膜上皮細胞HCEC-IIを用い、スクラッチアッセイで評価した。また、細胞増殖促進効果はEdU標識及びMTTアッセイにより測定した。さらに、PACAPによる創傷治癒に関与する重要な因子を検討には、DNAマイクロアレイ法を用いた。スクラッチアッセイの結果、PACAP投与により創傷治癒効果があることが示された。この創傷治癒効果は細胞の増殖性及び走化性の上昇によるものであることが推定され、特に増殖性の上昇によるものであることがEdU標識により示唆された。

今後の研究の推進方策

ドライ症候群に対するPACAPの作用機序とその分子機構の全容解明を行う。そのためにまず副交感神経ネットワークを介したPACAPの外分泌腺分泌機構の解明を目指す。さらに、PACAP投与後の涙腺の外分泌腺刺激による涙液分泌機構をアクアポリン(AQP5)ファミリー発現動態から解明しその分子機構を動物実験と培養実験によりしらべる。涙腺におけるPACAPの涙液分泌促進作用について培養実験を行う。培養下で涙腺にPACAPを投与し、細胞内Ca濃度変化を測定し、さらに種々の阻害剤を用いて実験を行い、PACAPがPAC1受容体を介して涙液分泌を促進する可能性をしらべる。またPACAP投与によって涙腺のAQP5がリン酸化を受けて水チャンネル分子を活性化させるかどうかを培養実験でしらべる。同時にPACAPが副交感神経を介して作用するのかあるいは単独に作用するのかコリン作動性の受容体（ムスカリニック受容体）の阻害剤などを使用して確定する。さらに、CRISPR-Cas9システムを用いたPAC1R, VPAC1R,VPAC2R KOマウスを作出することを目指す。現在、PAC1Rの遺伝子欠損マウスのF0が12匹生まれてきたのでそれらを交配してF1世代を作出中である。これらの動物個体を繁殖させて動物実験および培養実験を行う予定である。また慶應大学の坪田教授の協力をえて、今後はヒトでのPACAP点眼による涙液分泌促進作用をしらべていく予定である。さらにヒトの倫理委員会を通じてドライアイ患者へのPACAP点眼を行えるような体制を構築していく予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Analgesic effect of mineral cream containing natural spa minerals for use on the skin. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hirabayashi T, Yamashita M, Wada N, Takenoya F, Ikeda H, Kamei J, Ryushi T, Yamamoto N, Shioda S.
  • 雑誌名: Biomed Res. 巻: 39 ページ: 215-222
  • DOI: 10.2220/biomedres.39.215.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Anti-stress action of lavender oil and its component analysis of mice and humans. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takenoya F, Mimori A, Hirabayashi T, Shibato J, Kimura A, Shioda S.
  • 雑誌名: J Jpn Soc Aromatherapy 巻: 1 ページ: 7-14
  • 査読あり
• [雑誌論文] Activation of AMPK-Regulated CRH Neurons in the PVH is Sufficient and Necessary to Induce Dietary Preference for Carbohydrate over Fat. (2018)
  • 著者名/発表者名: Okamoto S, Sato T, Tateyama M, Kageyama H, Maejima Y, Nakata M, Hirako S, Matsuo T, Kyaw S, Shiuchi T, Toda C, Sedbazar U, Saito K, Asgar NF, Zhang B, Yokota S, Kobayashi K, Foufelle F, Nakazato M, Masuzaki H, Shioda S, Yada T, Kahn BB, Minokoshi Y.
  • 雑誌名: Cell Rep. 巻: 22 ページ: 706-721
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2017.11.102.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Distribution of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide 2 in zebrafish brain. (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakamachi T, Kamata E, Tanigawa A, Konno N, Shioda S, Matsuda K.
  • 雑誌名: Peptides. 巻: 103 ページ: 40-47
  • DOI: 10.1016/j.peptides.2018.03.006.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Progress Toward Rice Seed OMICS in Low-Level Gamma Radiation Environment in Iitate Village, Fukushima. (2018)
  • 著者名/発表者名: Rakwal R, Hayashi G, Shibato J, Deepak SA, Gundimeda S, Simha U, Padmanaban A, Gupta R, Han SI, Kim ST, Kubo A, Imanaka T, Fukumoto M, Agrawal GK, Shioda S.
  • 雑誌名: J Hered. 巻: 109 ページ: 206-211
  • DOI: 0.1093/jhered/esx071.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Dentate granule progenitor cell properties are rapidly altered soon after birth. (2018)
  • 著者名/発表者名: Matsue K, Minakawa S, Kashiwagi T, Toda K, Sato T, Shioda S, Seki T.
  • 雑誌名: Brain Struct Funct. 巻: 223 ページ: 357-369
  • DOI: 10.1007/s00429-017-1499-7.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Prostaglandin D2 Induces Ca2+ Sensitization of Contraction without Affecting Cytosolic Ca2+ Level in Bronchial Smooth Muscle. (2018)
  • 著者名/発表者名: Suto W, Ando Y, Hirabayashi T, Takenoya F, Shioda S, Kamei J, Sakai H, Chiba Y.
  • 雑誌名: Int J Mol Sci. 巻: 19 ページ: 3036
  • DOI: 10.3390/ijms19103036.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Discovery of PACAP and its receptors in the brain. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hirabayashi T, Nakamachi T, Shioda S.
  • 雑誌名: J Headache Pain. 巻: 19 ページ: 28
  • DOI: 10.1186/s10194-018-0855-1.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effects of PACAP on Dry Eye Symptoms, and Possible Use for Therapeutic Application. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shioda S, Takenoya F, Hirabayashi T, Wada N, Seki T, Nonaka N, Nakamachi T.
  • 雑誌名: J Mol Neurosci. 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1007/s12031-018-1087-1.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Regulation of feeding behavior and energy metabolism by galanin-like peptide. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takenoya F, Hirako S, Wada N, Nonaka N, Hirabayashi T, Kageyama H, Shoida S.
  • 雑誌名: Curr Pharmac Design 巻: 24 ページ: 3926-3933
  • DOI: 10.2174/1381612824666181106111623.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neuropeptides: From Bench to Bedside. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shioda S, Gozes I.
  • 雑誌名: Curr Pharmac Design 巻: 24 ページ: 3867
  • DOI: 10.2174/138161282433190109122611.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Functional analysis of promotion of sweat secretion by PACAP (2018)
  • 著者名/発表者名: Hirabayashi T, Endo S, Shioda M, Nakamachi T, Sasaki S, Takenoya F, Harvey BJP, Shioda S.
  • 学会等名: GPCR International Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] Functional analysis of dry syndrome by PACAP and its prevention and possible use for therapeutic application. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shioda S, Nakamachi T, Hirabayashi T, Takenoya F, Wada N, Nonaka N, Shibato J.
  • 学会等名: GPCR International Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 芳香療法による認知症の予防・改善について (2018)
  • 著者名/発表者名: 塩田 清二
  • 学会等名: 統合医療シンポジウム 中日統合医療健康美化発表会
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 高齢化社会における先端医療と新ビジネスの創造 ～認知症予防と芳香療法・再生医療～ (2018)
  • 著者名/発表者名: 塩田清二
  • 学会等名: 日本経済研究所 平成３０年度第会東京講演会
  • 招待講演
• [学会発表] さくら香りによる脳機能および生理的解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 竹ノ谷 文子、平林 敬浩、山田啓司、倉澤 貴美子、塩田 清二
  • 学会等名: 第21回 日本アロマセラピー 学会学術総会
• [学会発表] 「さくら」のセルエキストラクトによる生理作用について (2018)
  • 著者名/発表者名: 竹ノ谷 文子、倉澤 貴美子、山田啓司、塩田 清二
  • 学会等名: 第21回 日本アロマセラピー 学会学術総会
• [学会発表] アロマセラピーと地方創生活性化事業について (2018)
  • 著者名/発表者名: 塩田 清二
  • 学会等名: 第21回 日本アロマセラピー 学会学術総会
  • 招待講演
• [学会発表] アロマセラピーによる認知症の予防・改善 (2018)
  • 著者名/発表者名: 塩田 清二
  • 学会等名: 日本アロマセラピー学会九州地方会
  • 招待講演
• [学会発表] 低温真空抽出法によるさくらセルエキストラクトの美白効果について (2018)
  • 著者名/発表者名: 守谷 友里恵, 柴藤 淳子, 平林 敬浩, 木村 愛, 千葉 義彦, 竹ノ谷 文子, 塩田 清二
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会
• [学会発表] アレルギー性喘息モデルマウスの気管支平滑筋における PACAP 受容体 Adcyap1r1 発現の減少 (2018)
  • 著者名/発表者名: 上田 千裕, 神野 奈緒子, 須藤 航, 平林 敬浩, 竹ノ谷 文子, 塩田 清二, 髙﨑 一朗, 酒井 寛泰 , 千葉 義彦
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会
• [学会発表] 神経ペプチド PACAP による唾液分泌促進機構の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山下 道生, 平林 敬浩, 中町 智哉, 矢田 俊彦, 千葉 義彦, 竹ノ谷 文子, 塩田 清二
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会
• [学会発表] さくらの香りによる人体への生理作用について (2018)
  • 著者名/発表者名: 福本 勘太, 柴藤 淳子, 平林 敬浩, 山下 道生, 木村 愛, 岩崎 雄介 千葉 義彦, 竹ノ谷 文子 , 塩田 清二
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会
• [学会発表] 白色ラベンダー「美郷雪華」の芳香成分による中枢神経系への生理作用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 野中 瑞希, 木村 愛, 山田 啓司, 福本 勘太, 平林 敬浩, 千葉 義彦, 竹ノ谷 文子, 塩田 清二
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会
• [学会発表] 汗腺不死化細胞を用いた PACAP の汗分泌促進作用について (2018)
  • 著者名/発表者名: 塩田 美冬, 遠藤 沙也花, 山下 道生, 平林 敬浩, 柴藤 淳子, 千葉 義彦, 竹ノ谷 文子, 塩田 清二
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会
• [学会発表] PC12 細胞における PACAP の突起伸長の分子機構 (2018)
  • 著者名/発表者名: 遠藤 沙也花, 塩田 美冬, 山下 道生, 平林 敬浩 柴藤 淳子, 千葉 義彦, 竹ノ谷 文子, 塩田 清二
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会
• [学会発表] 虚血再灌流 in vitro 実験系を用いた PACAP の細胞死抑制機構の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 石野 茉由子, 橋口 友紀, 山崎 茉由, 山下 道生, 平林 敬浩, 柴藤 淳子, 千葉 義彦, 竹ノ谷 文子, 塩田 清二
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会
• [学会発表] ラベンダー精油による抗ストレス作用について (2018)
  • 著者名/発表者名: 竹ノ谷 文子、平林 敬浩、山本 憲志、琉子 友男、塩田 清二
  • 学会等名: 第74回 日本体力医学会大会
• [図書] 動物学の百科事典 (2018)
  • 著者名/発表者名: 塩田清二
  • 総ページ数: 808
  • 出版者: 丸善出版
  • ISBN: 978-4-621-30309-2