デジタル3D神経病理学の創成

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K20468
• 配分区分: 基金
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 柿田 明美 新潟大学, 脳研究所, 教授 (80281012)
• 研究分担者: 北浦 弘樹 新潟大学, 脳研究所, 特任准教授 (80401769) ; 田井中 一貴 新潟大学, 脳研究所, 教授 (80506113) ; 齋藤 理恵 新潟大学, 脳研究所, 助教 (80829078)
• 研究期間 (年度): 2020-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 神経病理学 / デジタル画像 / 組織病理

研究実績の概要

神経病理学的診断を行っていると、通常の組織標本、つまり２次元平面に薄切した標本の観察では、脳病変を正しく評価できないのではないか、と思うことがある。脳は、つくりが複雑で機能単位がことさら立体的だからである。本研究では、ヒト脳組織透明化・3Dイメージング技術を用いて、ヒト脳における神経細胞やグリア細胞の配列やネットワーク、更には微小血管の分布を３次元で鮮明に捉え、‘立体的機能ユニット’における正常と異常を明らかにする。つまり定量的なデジタル3D神経病理学を創成し、ブレインサイエンスにおける形態学的イノベーションを開拓することを目的とする。そのための技術開発を進め、病理診断の現場や研究におけるデファクトスタンダードに昇華させるため、(1) ‘立体的機能ユニット’を丸ごと解析するための多色繰り返し染色法と、(2) 微細構造観察のための高度組織膨潤透明化プロトコールを開発し、(3) ヒト標準脳3Dマップ “21世紀版ブロードマン地図” を作成する。そしてデジタル3D神経病理学の有用性を実証する計画である。
当該年度までに、ヒト脳組織透明化における最大の光学的課題：自家蛍光および褐変（マウス等の脳を透明化する際には特段問題とはならない）の克服に成功し、これらを高度に抑制する透明化プロトコール：いわば「ヒト脳組織に特化した透明化試薬」の開発に成功した。また、この手法に適用可能な3D用各種一般蛍光染色およびホールマウント免疫染色技術を確立した。脳小血管病やてんかん原性限局性皮質異形成を対象とした、脳血管の構築異常や神経細胞の配列異常を捉えることに成功した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究では、ヒト脳における‘立体的機能ユニット’を明らかにすることを目指している。既に、ヒト組織標本を高度に透明化する新たな水溶性透明化試薬の開発に成功し、ヒト脳の3D染色法とホールマウント免疫染色法を確立した。この技術を病理診断の現場や研究におけるデファクトスタンダードに昇華させるため、今後の研究方針を進める基盤が確立した。また代表的な脳疾患である脳小血管病と限局性皮質異形成の組織を対象とした検証を進め、疾患を特徴付ける可能性がある所見を捉えた。そのため、現在までの進捗状況として、おおむね順調に進展している、と評価した。

今後の研究の推進方策

以下の2つの課題に対する解決策を講じる。
課題(1)：多色の画像重ね合わせ：現状の3Dイメージングでは、一回の染色操作で4色までのマルチカラーイメージングが可能である。貴重なヒト脳標本における‘立体的機能ユニット’を丸ごと解析するためには更に多色での標識技術が必要である。そこで繰り返し染色法を開発する。
課題(2)：微細構造の観察技術：シート照明蛍光顕微鏡を用いた光学系は、本研究目的に叶う1 cm3ブロック超の大きな組織を高速で観察できる。ただし、倍率4倍での観察になるためオルガネラレベルでの異常を検出することは苦手である。高度組織膨潤透明化プロトコールを確立し、この弱点を克服する。
研究方法：＜繰り返し染色法の開発および高度組織膨潤透明化手法の開発＞
予備実験の結果、染色済みの透明化組織は脱脂処理により脱色されることを見出した。そこで、脱脂処理の更なる最適化（試薬の組成・温度・時間）を図ることで、高効率な脱色条件を探索する。繰り返し染色により、1 cm3 超の標本における神経細胞・グリア細胞・微小血管・髄鞘・老人斑など、多種類の構造体を丸ごと可視化するイメージング基盤を確立する。また、オルガネラ解像度の3Dイメージングを実現するために高度組織膨潤透明化手法の開発を行う。

次年度使用額が生じた理由

購入を予定していた試薬（国外企業が販売）が、（おそらく）新型コロナウイルス感染症拡大の影響で、製造・販売が保留となった。そこで、代替品の購入ではなく、当初の予定試薬を次年度に購入することとし、予算を次年度に繰り越した。

研究成果

• [雑誌論文] Genetic variations and neuropathologic features of patients with PARK2. (2021)
  • 著者名/発表者名: Seike N, Yokoseki A, Takeuchi R, Saito K, Miyahara H, Miyashita A, Ikeda T, Aida I, Nakajima T, Kanazawa M, Wakabayashi M, Toyoshima Y, Takahashi H, Matumoro R, Toda T, Onodera O, Ishikawa A, Ikeuchi T, Kakita A.
  • 雑誌名: Mov Disord 巻: 36 ページ: 1634-1643
  • DOI: 10.1002/mds.28521
  • 査読あり
• [雑誌論文] Proteomic profile differentiating between mesial temporal lobe epilepsy with and without hippocampal sclerosis. (2020)
  • 著者名/発表者名: Furukawa A, Kakita A, Chiba Y, Kameyama S, Shimada A.
  • 雑誌名: Epilepsy Res 巻: 168 ページ: 106502
  • DOI: 10.1016/j.eplepsyres.2020.106502.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel CHP1 mutation in autosomal-recessive cerebellar ataxia: autopsy features of two siblings. (2020)
  • 著者名/発表者名: Saito R, Hara N, Tada M, Honma Y, Miyashita A, Onodera O, Ikeuchi T, Kakita A.
  • 雑誌名: Acta Neuropathol Commun 巻: 8 ページ: 134
  • DOI: 10.1186/s40478-020-01008-2.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Oculopharyngodistal myopathy with coexisting histology of systemic neuronal intranuclear inclusion disease: clinicopathologic features of an autopsied patient harboring CGG repeat expansions in LRP12. (2020)
  • 著者名/発表者名: Saito R, Shimizu H, Miura T, Hara N, Miyashita A, Kawachi I, Sanpei K, Honma Y, Onodera O, Ikeuchi T, Kakita A.
  • 雑誌名: Acta Neuropathol Commun 巻: 8 ページ: 75
  • DOI: 10.1186/s40478-020-00945-2.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. (2020)
  • 著者名/発表者名: Susaki EA, Shimizu C, Kuno A, Tainaka K, Li X, Nishi K, Morishima K, Ono H, Oda KL, Saeki Y, Miyamichi K, Isa K, Yokoyama C, Kitaura H, Ikemura M, Ushiku T, Shimizu Y, Saito T, Saido TC, Fukayama M, Onoe H, Touhara K, Isa T, Kakita A, Shibayama M, Ueda HR.
  • 雑誌名: Nat Commun 巻: 11 ページ: 1982
  • DOI: 10.1038/s41467-020-15906-5.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 3D pathology of cerebral amyloid antipathy based on tissue clearing technique. (2020)
  • 著者名/発表者名: Inoue M, Saito R, Kakita A, Tainaka K.
  • 学会等名: 第61回日本神経病理学会
• [学会発表] 結節性硬化症のてんかん焦点組織特性. (2020)
  • 著者名/発表者名: 北浦弘樹、福多真史、藤井幸彦、柿田明美.
  • 学会等名: 第61回日本神経病理学会
• [学会発表] てんかん外科病理学の実際：症例から学ぶ病態. (2020)
  • 著者名/発表者名: 柿田明美.
  • 学会等名: 第11回 アルツハイマー病とてんかんを考える会
  • 招待講演
• [学会発表] Pathologic features of juvenile parkinsonism. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kakita A.
  • 学会等名: MDS-AON
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Pathologic features of cerebellar ataxia disorders. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kakita A.
  • 学会等名: MDS-AON
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] てんかんの外科病理. (2020)
  • 著者名/発表者名: 柿田明美.
  • 学会等名: 第44回 日本てんかん外科学会.
  • 招待講演