| 研究課題/領域番号 |
20K20472
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| 配分区分 | 基金 |
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
尾崎 倫孝 北海道大学, 保健科学研究院, 教授 (80256510)
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| 研究分担者 |
小澤 岳昌 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (40302806)
森田 直樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 総括研究主幹 (60371085)
芳賀 早苗 北海道大学, 保健科学研究院, 特任講師 (60706505)
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| 研究期間 (年度) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 光治療 / ランタニド・ナノ粒子 / がん治療 / プログラム細胞死 / 光プローブ |
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| 研究実績の概要 |
１）新たに候補とした細胞死（ネクロプトーシス、パータナトス）の生物学的な意義を検討し、他の細胞死（アポトーシスなど）と比較検討した。また、細胞死前後の炎症誘導性（炎症性サイトカインの遺伝子発現）を検討した。前者は抗腫瘍目的とした治療ターゲットとしてより優れた有効性・可能性の視点から検討するために、後者は治療による副作用の出現の可能性を評価するために行った。プログラム細胞死の相互関係と細胞死誘導能の強弱あるいはタイミングを比較検討し、細胞へのストレスの後に変化する細胞内分子の変化とともに、経時的に起こる細胞死の時間経過と強さのバランスを明らかとした。
２）細胞内へ導入する光感受性プローブのデザイン・作製と検証。光照射システムを構築するにあたり、①青色光にて遺伝子発現を誘導するGal4-VVD-p65システムが機能することを確認した（ルシフェラーゼ遺伝子発現にて評価）、②青色光を感受し二量体を形成するタンパク質CRY2およびCIBNを利用した分子活性化プローブ（Akt分子の活性化にて評価）をデザイン・作製した。それらを細胞内に導入し、青色光による分子操作を試みた。作製した光感受性プローブを細胞内に一過性に発現させ機能を確認した。青色光照射により、Gal4-VVD-p65システムは機能し、ルシフェラーゼ遺伝子発現を誘導した。また、同様にAkt分子は細胞膜近傍に移動し活性化した。
３）近赤外光をランタニド・ナノ粒子（LNP）に照射することにより、アップ・コンバージョンされ青色光を発することを確認した。今後、アップ・コンバージョンした青色光が、青色光感受性プローブを細胞内で機能させることが出来るかどうかを検討し、近赤外光照射の回数・時間・強度により、どの程度細胞内分子機能に影響するかなどの条件検討を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
令和2年度は、コロナ感染対策により5月から実験施設の使用制限がかかり、細胞実験の遂行には予想以上に時間を要した。また、試薬・ディスポーザブル等の不足などもあり調達に時間がかかったため、全体的に実験の進行が遅くなった。
１）プログラム細胞死の解析：新たな細胞死（ネクロプトーシス、パータナトス）の検討を追加して行う必要が生じ、アポトーシスとの比較検討等を追加的に行ったため、当初の予定より時間を要した。どのようなプログラム細胞死ががん治療により適しているかを検討するための基礎的実験を開始したが、特に新しい細胞死（ネクロプトーシス、パータナトス）を重点的に解析した。これら3種類の細胞死に対して、光プローブをもちいた動的な検討、分子生物学的な検討、生化学的な検討を行い、それぞれの細胞死の発現のタイミング、強さから、治療への応用可能性の高い細胞死を検討することが出来た。プローブ化のための予備調査が継続することで、若干プローブ作製のプロセスが遅れることとなったが、新たな細胞死が適切な治療ターゲットとなり得ると結論できた。
２）近赤外光のランタニド・ナノ粒子（LNP）を用いたアップ・コンバージョン：ほぼ予定通りに進んでいる。令和元年度に作製した近赤外光照射装置を用いて、LNPを用いたアップ・コンバージョン実験を行った。近赤外光照射装置は、タイマーにより光照射時間をプログラムし、光強度調整可能であり、LNPは0.5-2.0マイクロメーターのものを作製し、培養ディッシュ底に固着させた、これにより、近赤外光を照射し、アップ・コンバージョンによる青色光を底面から培養細胞に照射することが可能であった。今後、１）にて検討した細胞死を誘導する光プローブをデザイン・作製し、細胞レベルでこのシステムが機能するかどうかを検証する。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）プログラム細胞死の生物学的・病態学的意義から（細胞死が誘導されるタイミング、強さ、持続等から）、治療に向けた有効性を検討し、各種細胞死を誘導する光プローブをデザイン・作製する。「アポトーシス」は、カスパーゼ３遺伝子あるいはHarakiri遺伝を利用してプローブを作製する。「パータナトス」は、MLKLの重合化を起こす変異MLKL遺伝子を作製する。「ネクロプトーシス」は、核内へ自動的に移動する変異AIF（あるいは、truncated AIF）をデザイン・作製する。最初は、通常の強力なプロモータ下で発現するプローブを作製し、一過性に細胞に発現したところで、どの程度細胞死を誘導できるかを比較検討する。癌治療に最も適したと考えられる細胞死誘導プローブを決定した後、青色光依存性の光プローブを作製する（Gal4-VVD-p65発現系）。必要に応じて、青色光を感受し二量体を形成するCRY2＝CIBNを利用してプローブをデザインする。もっとも効果的にがん細胞死を誘導するプローブを選定し、それを安定的にがん細胞株に発現させた後に、小動物実験に進む。
２）細胞用の近赤外光照射装置を用いて、以下の検討を行う。近赤外光をランタニド・ナノ粒子（LNP）に照射することにより、アップ・コンバージョンされた青色光が、光プローブにより光操作出来るかどうかを検討する（その際、LNPは培養皿底に固着あるいは細胞とコンジュゲートする）。光照射による細胞内分子の変化が起こるかどうかを確認した後、近赤外光照射の回数・時間・強度により、どの程度細胞内分子機能に影響するかなどの条件検討を行い、小動物実験に進む。
３）小動物実験：小動物用の近赤外光照射装置を作製する。細胞死を誘導する光プローブを安定導入したがん細胞とLNPを、ヌードマウス（あるいはSCIDマウス）に移植し、光治療の可能性（腫瘍縮小効果）を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度は、コロナ感染対策により5月から実験施設の使用制限がかかり、実験の遂行には予想以上に時間を要した。また、試薬・ディスポーザブル等の不足などもあり調達にも時間がかかったため、全体的に実験の進行が遅くなった。また、新規に関与が確認されたプログラム細胞死の解析（ネクロプトーシス、パータナトス）と、これまで検討していたアポトーシス細胞死との比較検討、評価等を行う必要が生じたため、当初の予定より時間を要した。
今後、プログラム細胞死のがん治療における有効性を検討し、細胞死を誘導する光プローブをデザイン・作製する。もっとも効果的にがん細胞死を誘導するプローブを選定し、安定的にがん細胞株に発現させる。また、細胞用の近赤外光照射装置を用いて、近赤外光をランタニド・ナノ粒子（LNP）に照射することにより、アップ・コンバージョンされた青色光が、光プローブにより光操作出来るかどうかを検討する。光照射による細胞内分子の変化が起こせるかどうかを確認した後、近赤外光照射の回数・時間・強度により、どの程度細胞内分子機能に影響するかなどの条件検討を行う。
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