| 研究課題/領域番号 |
20K20566
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
吉村 英哲 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (90464205)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | 生物発光 / バイオイメージング / 1細胞解析 / 遺伝子発現 / 顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では細胞集団サンプルにおける遺伝子発現プロファイルを、サンプルを生かしたまま1細胞解像度で可視化経時追跡する技術の創出を目指している。この目的のために開発する技術の軸として、生物発光を利用した遺伝子発現検出プローブの開発と広視野・高解像度生物発光顕微鏡の開発を行う。
生物発光遺伝子発現検出プローブについては、申請書でも述べたとおり予備実験として標的遺伝子を発現している細胞にて発光を示すプロトタイプの開発を進めていた。2020年度は本プローブの定量可視化性能を評価するため生細胞において標的遺伝子発現量をその遺伝子から翻訳反応によって生成する蛍光タンパク質からの蛍光強度で評価し、プローブの生物発光値との相関をとった。その結果、蛍光強度と生物発光値に有意な相関が見られた。一方で生物発光値にはばらつきが見られたことから、サンプルである細胞内でのプローブの発現量がより精度の高い遺伝子発現可視化検出に重要であることがわかった。
広視野・高感度生物発光顕微鏡の開発研究においては、当初計画通りレンズアレイを用いた立体視光学系の構築を試みた。プロトタイプとして市販のレンズアレイを購入し、これをカメラレンズとすることで複数のサンプル像を１つのイメージセンサーに結像する検出光学系を構築した。現在この検出光学系により、1つのイメージセンサー上に同じサンプル像を複数結像することが可能となっている。今後この光学系を調整し、視差または焦点位置の相違を利用した3次元観察顕微鏡を開発する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究では3年間の研究期間において生体サンプル内で遺伝子発現を可視化定量できるプローブの開発と広視野・高感度生物発光顕微鏡の構築を目標としている。そのうち前者のプローブ開発において、上記「研究実績の概要」に記載したとおり、1年目完了時点で細胞内において定量的に遺伝子発現を可視化するプローブの構築が実現した。今後このプローブの汎用性や検出感度を評価することになるが、1年未満の研究期間でプローブ開発の最も重要な課題をクリアしたと言える。
もう一方の開発課題である広視野・高解像度生物発光顕微鏡の開発においても、当初計画通り検出系にレンズアレイを導入した光学系を構築し、概ね研究計画通り順調に進められている。
以上から総合的に判断して、当初の計画以上に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究の主要な開発項目の内、プローブ開発については2つの方向で研究をすすめる。1つは前年度に確立した、遺伝子発現を定量解析できるプロトタイププローブについて、サンプル細胞内での発現量を安定させ、より高い定量性を実現することである。そのため、プローブの判定発現細胞株の作成やウイルスベクターを用いたより発現量ばらつきの小さな細胞作成法を試みる。もう1つは本プローブが様々な遺伝子発現に対応できるよう、汎用化を目指すことである。現在ターゲットとしている遺伝子はactb遺伝子である。今後はactbに加え、様々な遺伝子およびRNA酸性に対応できるようプローブバリエーションを増やす。候補としてはこれまでに自身で実績のあるテロメアからの転写産物であるTERRAの発現について生物発光で可視化定量検出できる技術の構築を目指す。
顕微鏡開発については広視野化を目指すため、低倍率かつ高画素数の対物レンズやカメラの組み合わせを試験し、生物発光検出脳について評価する。特に対物レンズの倍率を下げることで視野を広げられる一方、開口数が下がると画像が暗くなり生物発光の検出が困難になる恐れがある。倍率と開口数のバランスがよい、生物発光検出に適したレンズを選定する。あるいはよりシンプルな単レンズを利用した検出系も検討する。3次元化においては現在構築中のレンズアレイを用いた検出系で視差や焦点位置の差の利用を検討する。また焦点深度についても評価し、サンプルの3次元像を構築するために必要な分割像の数についても検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度はCOVID19の影響のため研究にさく時間がどうしても短くなった。そのため、研究計画に含まれていた顕微鏡開発の作業を検出系に特化して行ったことから、使用額が抑えられた。今年度以降は顕微鏡システム全体の構築を進めるため、多数の光学部品の購入が見込まれる。また遺伝子発現生物発光プローブの開発については大きな影響は出ておらず、むしろ当初の計画以上に進展している。したがって開発中の顕微鏡を用いた観察が実現するよう、顕微鏡システムの構築を急ぎぐため、今年度は多くの光学部品の購入を予定している。
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