| 研究課題/領域番号 |
20K20567
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
久保 拓也 京都大学, 工学研究科, 准教授 (20374994)
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| 研究分担者 |
佐藤 雄介 東北大学, 理学研究科, 准教授 (90583039)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | エクソソーム / スポンジモノリス / 糖鎖 / ヘリックスペプチド / 分離 |
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| 研究実績の概要 |
エクソソームの構造解析や機能解明に関する研究が積極的に展開されるなか，細胞培養液あるいは種々の生体試料中からの効率的なエクソソーム分離技術開発が急務である。現状，エクソソーム分離の手法としては，超遠心法が主流であり，同法ではサイズ依存の分離であるために，定性的なエクソソーム分離の単離は困難であり，種々の夾雑成分が含まれる可能性が高い。
そこで，本研究ではエクソソームの表面構造に着目し，特に表面糖鎖を選択的に捕捉可能なレクチンをリガンドとし，さらに，我々が先に開発した超高通水性の分離剤として期待されている多孔性高分子（スポンジモノリス，SPM）を分離基材とすることで，高選択的かつハイスループットなエクソソーム分離法開発を着想した。また，共同研究者らのヘリックスペプチドのエクソソーム認識能についても評価した。
SPMを基材とするレクチンカラムの作製と評価について，複数のレクチンに対するカラムを作製し，対応する糖タンパク質，糖鎖含有リポソーム及びエクソソームの選択的分離に成功した。一方で，現時点では常法を用いた精製法ではエクソソームの非特異吸着が確認されたが，エクソソーム溶液や溶離液への添加剤の利用によって，非特異吸着に対する問題が徐々に解消されつつあり，直近の評価ではレクチンカラムにおけるエクソソームの糖鎖に基づく選択的分離の可能性が見出された。また，アビジン―ビオチン反応を用いた新たな手法にも取り組んでおり，次年度へ向けてエクソソームの糖鎖構造サブクラス分離とその内容物の相違の評価を順調に進めている。また，共同研究者らの開発したヘリックスペプチドは，比較的粒子径の小さいエクソソームを選択的に認識することが示され，次年度の研究においては，このペプチドを用いた分離への応用を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
コロナウィルスの影響で，学外での発表等の情報発信はできていないが，研究は順調に進展している。本年度は，エクソソームのサブクラス分離が実現し，さらに内容物の差異も特定できると期待される。
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| 今後の研究の推進方策 |
両親媒性 α-helix ペプチド，抗体，レクチン SPMを用いて，エクソソーム包括的分離及び膜表面化学に基づくのサブクラス分離（回収率90％以上）を実現する。これらの達成目標を実現するために，次の項目についてそれぞれ評価を行う。
(1) SPM 基材の最適化（細孔径制御，エポキシ密度，親水化等）(2) 高曲率脂質二重膜認識に基づくエクソソームの包括的分離（新規両親媒性 α-helix ペプチドの合成と機能評価，ペプチドの SPM への固定化とエクソソームの分離）(3) 抗体及びレクチン固定化 SPM によるエクソソームの分離（各種抗体固定化 SPM によるテトラスパニン類捕捉とエクソソーム分離，レクチン固定化 SPM による糖鎖捕捉とエクソソーム分離。
上記課題 (2) では，エクソソームのサイズに依存する高曲率脂質二重膜を選択的に認識する新規ペプチド固定化 SPM を用いて，種々のエクソソームの包括的な分離の可能性を精査する。また，課題 (3) では，●テトラスパニン抗体固定化 SPM の合成と基礎機能性評価，●テトラスパニン抗体固定化 SPM を用いたエクソソーム分離と内容物同定，●アビジン―ビオチン標識レクチンを利用した SPM の合成と基礎評価，●新規レクチンモノリスによるエクソソームの選択分離と内容物同定，を順次行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画通りの消耗品費に加えて，研究員の増員を行うために，本年度の予算を充当する。
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