| 研究課題/領域番号 |
20K20567
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
久保 拓也 京都大学, 工学研究科, 准教授 (20374994)
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| 研究分担者 |
佐藤 雄介 東北大学, 理学研究科, 准教授 (90583039)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | エクソソーム / レクチン / クロマトグラフィー / 糖鎖 / プロテオーム |
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| 研究実績の概要 |
本研究では，エクソソームの糖鎖機能解明を目指し，レクチン固定化SPMの作製および評価と，作製したSPMを用いたエクソソームのレクチンアフィニテークロマトグラフィー (LAC) を行った。エクソソームの化学特性を規定する条件の一つである糖鎖構造に着目し，膜表面の糖鎖構造を利用した新規分離手法の開発に着手した。Poly(ethylene-co-glycidylmethacrylate) (PEGM) を基材とするSPM (PEGM-SPM) 表面に対して，sambucus sieboldiana agglutinin (SSA) またはconcanavalin A (ConA) を導入したカラムを作製し，HPLC (High Performance Liquid Chromatography) を用いて，各カラムにおけるエクソソームの分離選択性を評価した。PEGM-SPMをテフロン素材の中空カラムに充填し，SSAまたは ConA溶液 (2 mg/mL) を封入した後，40 °Cで24 hインキュベートすることでレクチン固定化カラムを作製した。さらに，エクソソームの疎水性相互作用による非特異吸着を抑制するため，親水性ポリマーであるpolyvinylpyrrolidone で，SPMの疎水性表面をブロッキングした。作製したカラムを汎用のHPLCシステムに導入し，エクソソームに対するLAC測定を行った。その結果，エクソソームの一部がそれぞれのカラムに選択的に保持され，移動相へのhapten糖の添加によって，保持されたエクソソームを回収することが出来た。さらに回収したエクソソームについてLC-MS/MSによるプロテオーム解析を行ったところ，それぞれのカラムから溶出したエクソソームの構成タンパク質群が，大きく異なることが明らかとなった。これらの結果から，膜表面糖鎖種に基づくエクソソームのサブクラス分離に成功したことが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通り，膜表面糖鎖種に基づくエクソソームのサブクラス分離に成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
レクチン固定化カラムの大型化を目指し，分取サイズのSPMの合成を行う。また，得られたカラムに対して，細胞上清を直接流し，遠心分離を必要としない分離手法を開発する。
また，分担者の有する特殊なペプチドをSPMに固定化することで，エクソソームの包括的な分離を可能とする新たなSPM作製とその評価を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナの影響により出張旅費を使用しなかった。また，当初予定していた実験補助が不要であった。
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