| 研究課題/領域番号 |
20K20568
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
人見 清隆 名古屋大学, 創薬科学研究科, 教授 (00202276)
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| 研究分担者 |
村井 篤嗣 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (10313975)
大蔵 聡 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20263163)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | 表皮細胞 / タンパク質架橋化酵素 / 空気暴露 / 羊水 |
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| 研究実績の概要 |
本課題の目的は、表皮形成を細胞培養で再現する際に「空気暴露」が分化進行に必須な刺激となるメカニズムの解明と、その現象から着想した羊水からの表皮細胞分化制御因子の探索である。表皮細胞培養系を用いて空気暴露が分化進行に必要なメカニズムを解明する課題項目については、これまでに空気暴露の有無で差異のあった遺伝子群のなかから、低酸素応答に関する因子群が関与する可能性を新たに見出した。まず低酸素応答因子を制御する種々の薬剤を加えて、その関与が確実であることを確認した。また空気暴露の有無による分化の進行度の違いを、分化マーカー遺伝子を拡げて確認するとともに、従来用いていた初代培養細胞に加えて外来から遺伝子導入の容易な細胞株も含めて行った。これにより候補因子の欠損や過剰発現をさせて、その関与を解析することが可能になった。低酸素応答に関わるいくつかの因子について、レンチウイルスによる遺伝子導入発現システムを構築した。
一方、空気に接しないで表皮形成が行われる胎児の生育環境である羊水を、マウスおよびヤギから採取して解析を進めた。すでに羊水に表皮細胞分化を制御する因子の存在を確認していたので、それぞれ羊水をプロテアーゼ処理や熱処理を加えて、その効果が減じることからタンパク質成分と想定されることを明らかにした。また透析・限外ろ過によりおよその分子量サイズの情報も得た。これらの情報を得たのちに、イオン交換クロマトグラフィーを行って粗画分を得た。この中では、分化を促進する活性を確認できたことに加え、また分化マーカーの一つTG3（タンパク質架橋化酵素アイソザイム）の発現阻害活性を有する画分も別途に見出した。これらの活性画分を種々のアフィニティークロマトグラフィーにかけて精製に用いられるかどうかを調べつつ、併せてゲルろ過クロマトグラフィーに供した。その結果、特定の画分として得ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
細胞培養系において空気暴露が表皮分化刺激を与えるメカニズムの解明：ヒト表皮初代培養に加え、細胞株（Ker-CT）を用いて、改めて分化マーカーの種類を拡大して、空気暴露の有無での発現や角化度の違いを解析した。また、通常2週間で角化に至るところを、長期（8週）にわたって培養した際には空気暴露がない場合でも重層化することを見出した。しかし電子顕微鏡観察の結果からは著しく最外層に違いがあることを明らかにした。
空気暴露刺激が必須なメカニズムの解明に向けては、これまで行った発現遺伝子群の差異の解析（RNA-seq）結果から着目した、低酸素応答関連因子の関与について解析を進めた。低酸素応答の現象は、これまでも酸素分圧による様々な遺伝子発現制御を支配することが知られている。その情報を基に、まず関与を確実にするため数種の阻害剤・活性化剤を培養系に加えて変化が生じることを確認し、この刺激が細胞に伝達される際には低酸素応答が関与することを明らかにした。因子群を表皮細胞系に導入して発現・抑制するシステム作製も完了した。
羊水からの精製は、マウス・ヤギを給原に進めた。その際にまず、タンパク質成分が関与することを、羊水に対しプロテアーゼ・加熱・透析処理によって確認をした。該当年度はまず、マウスの大量の羊水を採取し、イオン交換クロマトグラフィーによって活性画分を追跡した。分画した羊水の活性は、表皮細胞への添加とその後の分化マーカー発現量で評価した。その結果、分化を促進する活性画分と、また別にタンパク質架橋化酵素TG3発現を特異的に抑制する画分があることを確認した。性状解析を主目的に、アフィニティークロマトグラフィーへの吸着を検討するとともに、分子サイズの推定できるゲルろ過クロマトグラフィーを行った。活性を分画物中に確認でき、含有される精製成分の同定は質量分析により可能であり進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
表皮培養の角化再現における空気暴露刺激において、低酸素応答の関与がひとつの可能性が有力と判明したので、関連する因子の遺伝子を入手するととともに、ヒト表皮細胞株を対象にしてレンチウイルス系での遺伝子導入を行う。この際、shRNAによる抑制、並びに過剰発現を行って、分化の度合いが影響されるかどうかを指標マーカーの増減を解析することで、その因果関係を確かめる。またシグナル伝達系について、阻害剤や影響のあった因子の下流で働く遺伝子群を調べて特定する。
併せて、長期培養により明らかになった、空気にさらさない場合での異常な重層(疑似角化)についても詳細な検討に入る。電子顕微鏡による観察をより詳細に行いつつ、長期に培養した際の遺伝子発現パターンの差異のデータ解析（RNA-seq）を、分化の後半においても行って、疑似角化と正常な角化に至る際の細胞内で生じる現象の違いを推測する。
羊水については、マウスを給原とした場合に、複数のクロマトグラフィーによって、一定の段階まで精製を進めることができたので、大量の入手が可能なヤギ羊水（研究分担者：大蔵）およびトリ有精卵（分担者：村井）とともに採取を進める。これらの精製をマウスでの精製で得られた情報を基にして進め、分化促進活性画分ならびにTG3（タンパク質架橋化酵素）の発現抑制活性画分の最終精製をめざす。すでにマウスについては質量分析による、同定を一部進めており、それとも比較検討をしながら、多段階の精製を行って最終同定する。
ヤギ羊水については将来的に、今回の精製成分を含め、含有成分が胎仔形成やその後成長における影響があるかを解析することを目指している。そのため羊水の部分採取を試み、既知の分化促進因子が解析できるかどうかを調べる。またこれまで代表者が得た、マウスの胎生段階における羊水解析結果も踏まえてその存在の検出系確立や測定も試みる。
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