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2020 年度 実施状況報告書

非標準的翻訳に着目した分化多能性メカニズムの拡張的理解

研究課題

研究課題/領域番号 20K20585
研究機関京都大学

研究代表者

高橋 和利  京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点准教授 (80432326)

研究分担者 岩崎 未央  京都大学, iPS細胞研究所, 特定助教 (10722811)
研究期間 (年度) 2020-07-30 – 2026-03-31
キーワード非標準的翻訳 / 分化多能性 / リボソーム / プロテオミクス
研究実績の概要

非標準的な翻訳を受けるRNA (non-canonical translated RNA: nctRNA) を網羅的にマッピングする目的で、ヒト分化多能性幹細胞 (H9 胚性幹 (embryonic stem: ES) 細胞株およびWTB6 人工多能性幹 (induced pluripotent stem:iPS) 細胞株) を用いて以下に示す試料を調製した。
1) 全RNA: すべての転写産物を網羅的に検出しnctRNAのマッピングに使用する。2) 核-細胞質分画RNA: マッピングしたそれぞれのRNAが細胞内のどこに局在するかを示す実験に使用する。3) ポリソーム分画RNA: 翻訳阻害薬であるCycloheximide (CHX) で処理し、リボソームとRNAを固定した状態でスクロースグラジエント法により分画したRNAを用いて、実際に翻訳されているRNAを検出するための実験に使用する。4) リボソーム結合RNA: 上記のようにCHX処理したRNAをRNaseで処理することで、消化されないリボソーム結合RNAをマッピングするための実験に使用する。
今年度は、上記の試料を調製し、RNAシークエンシングによるデータ取得を行った。また今後実施予定である、ヒト分化多能性幹細胞から作製した分化細胞における非標準的翻訳RNAプロファイリングの準備として、分化誘導の条件検討を実施し至適な分化誘導条件を決定した。また、マッピング後の機能的スクリーニングに用いるCRISPR interference (CRISPRi) の条件検討、細胞株の作製およびライブラリーの調製を行った。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

.

今後の研究の推進方策

2020年度に得たデータを用いて、インフォマティクス解析を実施し、RNAのマッピングおよびリボソームプロファイリングによる実際に翻訳されている領域の決定を行う。決定した翻訳領域の配列情報を、質量分析法を用いたタンパク質発現解析結果と照らし合わせる。nctRNAがコードするタンパク質はその多くが100アミノ酸以下であると考えられるため、細胞抽出液を透析膜処理し低分子量画分を濃縮することで発現量の低いタンパク質も確実に捉える。これにより、実際に翻訳されるRNAと実際に発現しているタンパク質を照らし合わせ、信頼性の高いマップを作成する。

次年度使用額が生じた理由

RNAシークエンシングおよび細胞培養に用いる消耗品の使用が当初の予定より少なくなったために、計上していた予算を下回った。本年度は昨年度未執行の予算を用いて、RNAシークエンシング、質量分析や大規模なスクリーニングを実施する。

  • 研究成果

    (2件)

すべて 2021 2020

すべて 学会発表 (2件) (うち招待講演 2件)

  • [学会発表] 細胞種依存的な翻訳制御因子NAT1の役割2021

    • 著者名/発表者名
      高橋和利
    • 学会等名
      再生医療学会
    • 招待講演
  • [学会発表] NAT1 is Required for Primed Pluripotency2020

    • 著者名/発表者名
      高橋和利
    • 学会等名
      分子生物学会年会
    • 招待講演

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公開日: 2021-12-27  

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