| 研究課題/領域番号 |
20K20631
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| 研究機関 | 横浜国立大学 |
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研究代表者 |
雨宮 隆 横浜国立大学, 大学院環境情報研究院, 教授 (60344149)
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| 研究分担者 |
中村 和幸 明治大学, 総合数理学部, 専任教授 (40462171)
山口 智彦 明治大学, 研究・知財戦略機構(中野), 特任教授 (70358232)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | アストロサイト / ニューロン / 乳酸代謝 / ANLS仮説 / 代謝振動 / 因果性 / CCM解析 / 時系列振動 |
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| 研究実績の概要 |
脳の高次機能や神経疾患に関わると考えられる脳細胞における乳酸の代謝動態の解明を目的として研究を進めている。そのために，アストロサイトで産生された乳酸がニューロンに輸送されて代謝されるというANLS（Astrocyte Neuron Lactate Shuttle）仮説の検証を行うこととした。アストロサイトで産生された乳酸がニューロンに輸送されて代謝されれば，これら2種類の細胞の間には乳酸輸送に関する因果性が生じる。そこで，申請者らが研究を行ってきた1細胞レベルの代謝振動現象を利用すれば，このような因果関係を統計学的に解析できるものと推論した。
そこで，アストロサイト／ニューロン混合培養系の確立と因果性解析のための統計学的手法の確立の2つを目的として研究を進めた。まず，マウス中枢神経系幹細胞株（MEB5）を用いた共培養系の実験を行った。各種培地組成を用いてMEB5の培養を試みたが，分化に必要な細胞密度に達する前に細胞が死滅する結果となり，本細胞株の培養は困難であることが分かった。そこで次に，マウス胚性腫瘍由来細胞株（P19C6）を選択した。この細胞株は接着性の腫瘍由来であることから，培養が比較的容易であると考えた。レチノイン酸の添加により，分化開始6日目に軸索を有しかつ増殖が見られないニューロンと思われる細胞に，また，10日目には軸索構造をもつ細胞とは別の形状をした増殖細胞のアストロサイトと思われる細胞が出現した。今後，免疫染色などによる細胞の同定が必要であるが，ANLS仮説の検証に必要なアストロサイト／ニューロン混合培養系の確立に向けて大きく前進した。
因果性の統計学的解析手法として，CCM（Convergent Cross Mapping）法をヒト子宮頚がんHeLa細胞スフェロイドの糖代謝振動に適用し，隣接細胞の相互作用をCCM強度として抽出できることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
アストロサイト／ニューロン混合培養系の確立に時間を要している。当初，ニューロン，アストロサイト，オリゴデンドロサイトに分化するマウス中枢神経系幹細胞株（MEB5）を用いて実験を進めていた。培地組成，pH，二酸化炭素濃度を変えて培養を行った。ある条件では，透過顕微鏡で白色または透明のsphereが形成され大きく成長したが，分化させるのに必要な細胞密度に達する前に死滅してしまった。文献を参考にしたり細胞の分譲機関に幾度となく問い合わせたが，結局細胞を増やすことができずに多くの時間を要した。そこで，MEB5を用いることは諦め，マウス胚性腫瘍由来細胞株（P19C6）に着目した。P19C6株は腫瘍由来の細胞株かつ接着細胞であるから，申請者らの研究室で培養しているがん細胞株のように比較的容易に培養が可能であると考えた。培地条件や基板材料を変えて培養を行ったところ，順調に増殖し，また，文献に記載されている通りに，分化開始から6日程度で軸索をもつニューロンと思われる細胞が現われ，分化開始10日目にはアストロサイト思われる細胞が出現した。今後，免疫染色などによる細胞の同定が必要であるが，P19C6株を用いることで，ANLSの検証に必要なアストロサイト／ニューロン混合培養系を確立できるものと考えている。
また，因果性解析については，当初Granger解析を念頭において研究を進めていたが，ヒト子宮頸がんHeLa細胞の糖代謝振動をモデルとして解析したところ，納得する結果が得られなかった。そこで，広く文献調査をおこなうことで，本研究が対象としている非線形振動の因果解析にはCCM（Convergent Cross Mapping）法が優れていることを見い出した。このような予備的解析や文献調査研究にも時間を要した。
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| 今後の研究の推進方策 |
実験では，アストロサイト／ニューロン混合培養系としてマウス胚性腫瘍由来細胞株（P19C6）を用いて研究を進める。安定した共培養系を確立するために，培地や基板などの培養条件を詰める。これまで，ニューロンとアストロサイトに分化したと思われる細胞が出現しているので，免疫染色などによる同定を行う。並行して，アストロサイト／ニューロン混合培養系を用いて，糖代謝振動の実験を行う。申請者らが確立した1細胞レベルの糖代謝振動計測法を用い，まずは，アストロサイト／ニューロン混合培養系において，細胞内のNADH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を指標として，脳細胞の解糖系振動をはじめて観察することを目指す。NADH振動する細胞がアストロサイトであるかニューロンであるかを，免疫染色法を併用して明らかにする。乳酸代謝に伴うミトコンドリア振動はローダミン系の膜電位感受性色素を用いて計測する。最終的に，NADH振動とミトコンドリア膜電位振動の因果性を解析し，アストロサイトからニューロンに乳酸が輸送されるというANLS仮説を直接証明することを目指す。
因果性解析については，アストロサイト／ニューロン混合培養系の確立とは別に進める。申請らは，ヒト子宮頸がんHeLa細胞の単層培養系あるいはスフェロイド（細胞塊）系の実験結果を有しているので，これらの実験結果を対象にNADH振動にともなう細胞間相互作用についてCCM（Convergent Cross Mapping）法を用いた因果性の解析を進める。さらに，既に論文発表しているがん細胞のNADH振動の数理モデルを用いて，糖代謝にともなう細胞間相互作用とその因果性に関する解析も並行して進める。
以上のように，アストロサイト／ニューロン混合培養系の確立，1細胞レベルの糖代謝振動の計測，因果性解析を同時に進め，最終的にANLS仮説の検証を目的として研究を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
最終年度の実験研究に使用するための経費を次年度に回したため。
コロナ感染拡大防止のため国内外の会議をオンライン開催で行ったため，当初使用予定であった旅費を全く使用しなかったため。
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