| 研究課題/領域番号 |
20K20942
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
瀬川 高弘 山梨大学, 大学院総合研究部, 特任助教 (90425835)
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| 研究分担者 |
西原 秀典 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (10450727)
甲能 直樹 独立行政法人国立科学博物館, 地学研究部, グループ長 (20250136)
米澤 隆弘 東京農業大学, 農学部, 准教授 (90508566)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| キーワード | 古代DNA / 絶滅動物 |
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| 研究実績の概要 |
かつて日本列島には多種多様な中型・大型の哺乳類が生息していたが，その多くが更新世後期(12万年-1万年前)に日本列島各地で絶滅した．本研究では国立科学博物館等の国内の研究機関に保管されている更新世の絶滅大型哺乳類標本から古代DNA解析をおこない，これまで未知であった大型絶滅動物の系統的位置づけや，日本列島への渡来経路と時期などを解明することを目的としている．
更新世の絶滅大型哺乳類標本中のDNAの残存量は極めて少なく，またDNAは断片化していることが知られている．そのため市販のDNA抽出試薬を用いることはできないことから，断片化された損傷DNAに対して，コンタミネーションを抑えながら収率の高いDNA抽出手法やゲノムライブラリー構築を行うプロトコールの確立を図った．
更新世のオオカミおよびヒグマ化石の標本内部からクリーンルーム下で無菌的にサンプリングし，DNAを抽出した．年代の古いDNAに特化した手法でショットガンメタゲノムライブラリーを作成し，次世代シーケンサーによる大規模解読をおこなった．シークエンスした古代メタゲノム配列データから，配列類似性を検索し系統解析をおこなった．また，試料の放射性炭素（14C）同位体解析から，標本の絶対年代を決定した．試料年代は約2-3万年前の個体であり，DNAの保存性は非常に悪く，断片化やDNAの死後の塩基置換等が多く見られたが，更新世オオカミおよびヒグマのミトコンドリアゲノムの構築に成功し，更新世の大型絶滅動物の系統の解明に成功した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
断片化された損傷DNAに対して，コンタミネーションを抑えながら収率の高いDNA抽出手法やゲノムライブラリー構築のプロトコールを改良・確立し，更新世の絶滅大型哺乳類であるオオカミおよびヒグマの標本から古代DNA解析に成功した．化石標本の表面には現生の微生物群が多く付着しているため，それらのコンタミネーションを極力排除するために，クリーン環境下において標本内部から試料を採取した．無菌的にDNAを抽出し，新たに構築した手法でゲノムライブラリーを作成した．イルミナ社の次世代シークエンサーを用いて大規模な古代メタゲノム配列データを取得し，それに対する高速配列類似性検索によって得られた哺乳類配列データを用いて系統解析をおこなった．
サンプルにはバクテリアや菌類などの微生物が大量に含まれており，オオカミおよびヒグマのDNAは相対的に少なかったが，独自の配列検索とフィルタリングをおこなうことでミトコンドリアゲノムの構築に成功した．今後の核遺伝子の分析から，詳細な系統や，渡来経路と時期が解き明かされることが期待される．
以上のように本研究は計画通り順調に進行中である．
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度に確立した最新の微量・短鎖DNA分析の先端的手法を用いて，更新世以降に日本列島から絶滅したニホンアシカや，昨年度とは別標本のオオカミの古代DNA解析を試みる．申請者らは試料の表面に付着したコンタミネーションの微生物を排除するために，無菌的に標本内部を採取する手法を独自に開発しており，これを用いてクリーン環境下において標本内部を採取する．無菌的に抽出したDNAをもとに，古代試料由来のDNAライブラリー構築に最適化された手法でゲノムライブラリーを作成し，イルミナ社の次世代シークエンサーを用いてゲノム配列を取得する．シークエンスした古代メタゲノム配列データに対して高速な配列類似性検索をおこなうことで大型哺乳類由来の古代DNA配列を抽出し，それを現存個体データと比較することで近縁な系統を推定する．
さらに核ゲノムの解析をおこなうことで，大陸集団と分岐した時期や遺伝的な交雑が起きた年代を推定する．古代ＤＮＡ解析では試料年代の情報から突然変異率を直接的に推定できるため，ベイズ法を用いて，過去の集団サイズの高精度な推定をおこなう．また，絶滅大型哺乳類の安定同位体解析をおこなうことで，食性の推定を試みる．さらに集団遺伝学的解析から，絶滅に向かう過程で集団サイズがどのように変動するのかを推定することで，過去の生物相の遷移の解明に挑戦する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウィルスの影響で、試薬の納期が予定よりも遅れたため
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