| 研究課題/領域番号 |
20K21272
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
中道 範人 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (90513440)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | 植物 / CK1 / CKL / リン酸化 / 近接タンパク質ラベリング |
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| 研究実績の概要 |
チオリン酸化反応を指標にして, アデニン骨格に分子修飾されたATPガンマ位チオリン酸アナログ2種類を十分に加水分解できるCKL4の作出を試みたが, 得ることができなかった. 一方, 構造を基盤としたタンパク質改変およびそれを使ったプロテオミクスが上手くいかない場合として, CKL多重変異体を使ったリン酸化プロテオミクスや, CKLタンパク質の相互作用因子の探索を研究計画段階では予定してた. 前者は変異体のさらなる作成および多重変異体の作成が, 後者は近接ラベリング法の適用が必要であり, 時間がかかるものと予想されていた. 本研究では, 12のCKL遺伝子を全てノックアウトするまでには至っていないものの, CKL遺伝子群の多重変異体の作成を着実に進めることができた. またCKLの近接タンパク質のin vivoラベリングを実施の前段階として, 別のタンパク質(ある時計転写因子)とTurboIDの融合タンパクを発現させる植物体を取ることに成功した. この形質転換植物は, この時計タンパク質のみの過剰発現体と類似した表現型を示したいたため, 本時計タンパクはTurboIDと融合しても機能的だと考えられた. この植物をビオチン処理すると, この時計タンパク質および未知のタンパク質がビオチン化されることがウエスタンブロッティング解析によって示された. 一方ビオチン処理なしのサンプルや, 野生型株をビオチン処理したもので若干のビオチン化タンパクが見られものの, 時計タンパク-TurboID融合発現植物をビオチン処理したものでは特異的なタンパクがビオチン化されていた. CKLタンパク質の近接ラベリングへの適用が極めて容易となった. CKLの基質タンパク質のin vivoでのリン酸化サイトをリン酸化プロテオミクスで同定することができた.
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画当初で, 本研究の中心的テーマとなると考えていた研究（ATPガンマ位チオリン酸アナログを使える変異型CKLの作成およびそれを使ったプロテオミクス）が技術的に行き詰まってしまった. しかしながら, バックアップの方策として考えていた実験は, 技術的な行き詰まりを迎えずに進んでいる. 多重変異体は完成していないものの, 着々と準備ができている. また近接タンパク質ラベリングは, 別タンパク質を使ったものであるが, 予想以上に順調である. 本研究室では, 異なる複数のタンパク質で近接ラベリングが成功しているため, CKLタンパク質への適用の道筋は明確になっている. さらにリン酸化ネットワーク全体像を知るために, 一部の基質タンパク質をモデルケースとして, その基質タンパク質を植物体から免疫沈降し, そのサンプルをプロテオミクス解析することで, 多くのリン酸化サイトを見出すことができた. 技術的にも大きな進展であったが, CKLのリン酸化ネットワークを理解するうえの基盤知見ともなるであろう. 以上, 当初の予定実験には頓挫してしまったものの, バックアップの方法が予想以上に成功しており, これらの知見や技術を使うことで, CKLのリン酸化ネットワークが明らかになると考えている.
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| 今後の研究の推進方策 |
成功しつつある実験を進める. CKL多重変異体のリン酸化プロテオミクスの実施を見据えて, 着実に多重変異体の作成を進める. 12のCKL遺伝子の完全な欠損体は致死になる可能性もあるが, その場合は重篤な発生異常を示さない多重変異体の利用を予定する. またCKL阻害剤を利用したリン酸化プロテオミクスもバックアップの実験として考えている. そのための化合物の処理の方法や利用する濃度などの条件検討はある程度終わっているため, 比較的スムーズに進むと考えている. CKLの相互作用因子の同定のために, TurboIDをCKLと融合させ, それを発現させ, CKL多重変異体の形質(リズムの長周期化)を相補する株を作出する. その上で, CKLの近接タンパク質ラベリングを行い, CKL自身および未知・既知のCKLの基質がビオチン化されることを確認する. その次にビオチン化されたタンパク質をストレプトアビジンビーズで濃縮し, プロテオミクスを実施することでCKLの近接タンパク質を一挙に同定する. すでに別の研究で多くのプロテオミクス解析を行っているが, 適切なコントロール実験(ビオチン化処理なし, 野生型株をビオチン処理する)を並行させることで, 擬似陽性を減らすことができる. CKLの基質タンパク質のリン酸化サイトを全てアラニン置換したタンパク質を植物体で発現させ, CKLによるリン酸化がどの程度減るのかを解析し, CKLリン酸化ネットワーク全貌の解明への手がかりとする.
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究計画当初に, 核となると予定していた実験が上手くいかなく, さらにそれを解決する方法を見出すことができなかった. しかしバックアップとして考えていた複数の実験が, 予想を上回ったかたちで成功しつつあり, その実験を中心とした研究計画に切り替えたため.
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