| 研究実績の概要 |
複数の生物からクローニングしたtRNAリガーゼ遺伝子の発現、精製を昨年度から引き続き試みた。可溶性画分への組換えタンパク質の蓄積が見られたコンストラクトについて精製を行い活性測定を行ったが、シロイヌナズナtRNAリガーゼと比較して顕著なリガーゼ活性の上昇は見られなかった。一方、前年度においてシロイヌナズナtRNAリガーゼであるAtRLG1の大腸菌による発現、精製を行ったが、可溶性画分に目的タンパク質は検出されたものの得られた精製タンパク質の量は十分でなく、改善する必要が考えられた。そこで、新たにチオレドキシンタグを付加すると共にコドン最適化をしたAtRLG1遺伝子を合成しコンストラクトを作成し、発現、精製を行なった。その結果、可溶性画分での目的タンパク質蓄積の改善が見られ、その結果、より精製度の高い組換えタンパク質が得られた。この組換えtRNAリガーゼを用いて、2’,3’環状リン酸基を生成するシロイヌナズナIRE1のRNA分解産物の末端の塩基配列の同定を試みた。具体的には、GFPをDEX誘導系により発現するシロイヌナズナにジチオスレイトール（DTT）処理を経時的に行いIRE1によるin vivo切断を誘起し、抽出したRNAを用いてtRNAリガーゼによるリンカーオリゴのライゲーション、RT-PCR産物のシーケンスにより、切断を受けたGFP RNAの末端の塩基配列の解析を行なった。その結果、GFP mRNAの広範な領域でのIRE1の切断を示唆する結果が得られた。今後は、シロイヌナズナire1ab変異体を用いて同様の実験を行い、末端の塩基配列がIRE1特異的に生成されているか調べるとともに、シロイヌナズナの内在性mRNAについても同様の解析を行う必要がある。
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