| 研究課題/領域番号 |
20K21291
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
杉本 真也 東京慈恵会医科大学, 医学部, 准教授 (60464393)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2024-03-31
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| キーワード | アミロイドーシス / 機能性アミロイド / 腸内細菌 / 透過電顕 / シーディング効果 / チオフラビンT / パーキンソン病 / アルツハイマー病 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、特定の腸内細菌が産生する機能性アミロイドが腸管などの末梢組織から中枢神経や全身に移行し、宿主のアミロイド前駆体タンパク質の構造変換を触媒することで、神経変性疾患を発症させるという新たな仮説を検証することである。
前年度までの研究により、パーキンソン病患者において優位に増加することが報告されているCatabacter属細菌の機能未知タンパク質が、大腸菌の機能性アミロイドCurliの構成タンパク質CsgAと低いながらも相同性を示すことを見出し、本タンパク質をCatabacter amyloid-like protein A（CalA）と命名した。CalA遺伝子にCsgAのシグナルペプチド（1-20）および外膜輸送タンパク質CsgGの認識部位（21-43）を連結したキメラ遺伝子を合成し、大腸菌で複製可能なプラスミドのIPTG誘導型プロモーターの下流に連結することで、CalA発現プラスミドを構築した。そしてCurliの産生をネガティブに制御する複数の因子を欠損させた株にCalA発現プラスミドを導入し、コンゴーレッド含有培地上でアミロイド線維の産生を評価した。その結果、CalA発現プラスミド導入株のコロニーが微弱ながら赤色を呈した。Alpha-Fold 2を用いてCalAの立体構造を予測したところ、CalAのN末端は天然変性領域であり、C末端側に4本のβストランドからなるβシート構造を形成することが示唆されたため、CalAのC末端ペプチド（CalA-C）を化学合成し、アミロイド線維を形成するかを検証した。その結果、チオフラビンT蛍光の増大が認められ、透過電顕観察により、枝分かれのない線維構造を形成することがわかった。さらに、CalA-Cをもとに作製したアミロイド様線維をSeedとして、CalA-Cモノマーの凝集体形成が促進されることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在までにCalA-CがチオフラビンT陽性の線維状凝集体を形成することと、このアミロイド様凝集体がSeeding効果を有することを確認した。しかし、CalA-Cのアミロイド様凝集体がアミロイド線維のクライテリアの一つであるβシート構造を取るかについては定かではない。また、CalA-Cのアミロイド様凝集体がヒトのアミロイドーシスに関連するタンパク質・ペプチド（αシヌクレイン、アミロイドβ、Tauなど）のアミロイド線維形成に対してもSeeding効果を示すかについては検討できていない。以上のことから、やや遅れていると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2023年度は、CalA-Cがアミロイド線維を形成しやすい条件（ペプチド濃度、温度、時間、バッファー組成など）を精査し、CalA-Cのアミロイド様凝集体の二次構造をCDスペクトルを用いて解析する。次に、CalA-Cのアミロイド様凝集体がヒトのアミロイドーシスに関連するタンパク質・ペプチド（αシヌクレイン、アミロイドβ、Tauなど）のアミロイド線維形成に対してもSeeding効果を示すかを検討する。なお、これらのタンパク質・ペプチドはすでに入手済みであり、試験管内でアミロイド線維を形成することも確認済みである。また、CalA以外の腸内細菌由来機能性アミロイドの探索を実施する。これらの腸内細菌機能性アミロイド候補タンパク質が、真にアミロイド線維を形成することが確認された場合は、線虫のアミロイドーシスモデルを用いて、疾患発症に与える影響を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
CalA-CペプチドのSeeding効果を調べる実験条件の検討とその再現性の確認に時間を要し、当初計画してた外部委託によるCDスペクトル解析を2022年度内に実施することができなかったため、次年度使用額が生じた。2023年度は、CalA-Cペプチドのアミロイド様凝集体の2次構造をCDスペクトル測定で解析する費用として使用する。また、他の腸内細菌由来機能性アミロイド候補タンパク質について遺伝子組み換え実験を行うのに必要な経費（プライマー合成費、シーケンス解析費、DNAポリメラーゼなどの分子生物学実験用酵素、チップやチューブなどのプラスチック製品）として使用する。
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