| 研究課題/領域番号 |
20K21294
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
小山内 崇 明治大学, 農学部, 専任准教授 (60512316)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| キーワード | クエン酸回路 / シアノバクテリア / 代謝酵素 / アセチルCoA / 合成生物学 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、細胞内の代謝に非酵素的な反応が存在することを明らかにする。主に、シアノバクテリアのピルビン酸代謝とクエン酸回路を中心として、試験管内での生化学解析を進める。また、in vivoでは、酵素の改変株などを中心に代謝産物解析を行う。
代謝の再構成実験では、ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸を生成し、次にクエン酸またはリンゴ酸を生成する経路を試験管内で再構成した。この経路には、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC), リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(MDH), クエン酸シンターゼ(CS)の3つの酵素が存在するため、この３つの酵素を混合して、試験管内で反応を行った。このin vitro再構成実験により、クエン酸回路の方向性にはpHが特に影響し、アルカリ性に偏ると酸化的クエン酸回路へと炭素が流れることが明らかになった（Ito et al. 2021 Plant J）。
本来この反応ではオキサロ酢酸、リンゴ酸、クエン酸、CoAしかできないはずであるが、酢酸が生成されることが明らかになった。この酢酸の由来を調べたところ、アセチルCoAに由来することが明らかになった。今後はこの反応を詳細に調べていく予定である。
この他にも、シアノバクテリアや好熱性微細藻類のフマラーゼ（Ito et al. 2020 Front Microbiol）やクエン酸からイソクエン酸を合成するアコニターゼ（Nishii et al. submitted）の生化学解析を行い、クエン酸回路の方向性やフラックス（代謝の流れ）が代謝酵素に依存することが明らかになってきている。今後はさらに代謝酵素のラインナップをそろえるとともに、in vitroでの再構成や、in vivoでの代謝解析を行なっていく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
代謝の再構成実験では、PEPC, MDH, CSの3つを混ぜた反応を行い、pHをはじめとする代謝の流れを決定する要因を明らかにした。３つの酵素を混ぜる実験であるが、実は個別の酵素の解析を行なってもその流れは予測できない。３つの酵素があるために、基質の濃度が不規則に変化するため、その生化学反応は極めて複雑なものになる。このような細胞内を模倣した代謝反応の解析は実は非常に少ない。
この結果は、2021年に代表研究者が責任著者として、The Plant Journal誌に発表した（Ito et al. 2021 Plant J）。さらにこの論文は、同雑誌のResearch Highlightに選出され、雑誌のエディターが「Living microfactories」として2021年に記事を掲載している。
さらに2020年度は、酸化的ペントースリン酸経路とクエン酸回路の酵素が、クエン酸によって制御されていることも発見した（Ito et al. Biochem J）。シアノバクテリアの酸化的ペントースリン酸経路とクエン酸回路は、ともに還元力であるNADPHを生成する経路であるため、両方が活性化すると非常にバランスが悪い。このため、相互に制御する必要があるが、酸化的ペントースリン酸経路の主要な酵素が、クエン酸によって抑制されることがわかった。これにより、クエン酸回路が活性化しているときは、酸化的ペントースリン酸経路が抑制されることが示唆された。このように、経路レベルでの制御が明らかになった。
この他にも、オキサロ酢酸の分配にリンゴ酸デヒドロゲナーゼが重要であることを、遺伝子改変株を用いて明らかにした（Iijima et al. 2021 Metab Eng）。一方で、これら解析でも、通常の代謝反応では説明できない酢酸生成が起こっており、これまでの生化学解析と一致する結果となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はクエン酸回路の代謝の流れを、生化学および遺伝子改変株の代謝解析を用いてさらに明らかにする。
酸化的なTCA回路についてはクエン酸の代謝フラックスを詳細に調べる。クエン酸からはイソクエン酸が生成し、その後2-オキソグルタル酸が生成する。これらに関わるのがアコニターゼとイソクエン酸デヒドロゲナーゼである。これらの酵素の生化学解析を行うことで、オキサロ酢酸の分配に関わる酵素の解明をさらに進める。現在、アコニターゼの生化学解析の結果については、すでに論文投稿中であるが、リバイス実験などを経てさらにこの酵素の性質を明らかにする。また、これらの反応を通して、非酵素的な代謝産物の生成がないかを検証していく。
他の方向性としては、オキサロ酢酸から生成するリンゴ酸の分配に着目する。リンゴ酸からはフマラーゼによってフマル酸が生成し、リンゴ酸酵素によってピルビン酸が生成する。これらの酵素を組み合わせた生化学解析も重要である。また、リンゴ酸に関連する酵素遺伝子の改変株を作製し、代謝解析を行う。すでにリンゴ酸デヒドロゲナーゼについては過剰発現株に加えて欠損株も作製した。これらの株を用いて、シアノバクテリアのクエン酸回路の代謝産物の分配を詳細に調べていく。
フマラーゼについては、シアノバクテリアのシネコシスティスに加え、好熱性シアノバクテリアであるサーモシネココッカスエロンガータスと、真核紅藻であるシアニディシゾンメローラエの酵素も生成し、生化学解析を行なった（Ito et al. 2020 Front Microbiol）。これらの比較解析を行うことで、還元的なTCA回路の代謝の流れを明らかにできる可能性がある。また、これまではすべて生化学解析にとどまっているが、構造解析などについても視野に入れる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度は、コロナウイルスにより、４月から５月が完全に研究室での実験が停止となった。６月以降も徐々に再開したが、研究室の人数制限などは今に至るまで続いている。研究に関しては論文の執筆に注力したため、たくさんの論文を発表することができたが、研究費の使用に関しては残額が出ており、2021年度に使用することになった。
ただし、現在においても出張の制限や研究室の在室人数の制限などが続いている。
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