| 研究課題/領域番号 |
20K21310
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
吉岡 博文 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30240245)
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| 研究分担者 |
近藤 竜彦 名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (30362289)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2022-03-31
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| キーワード | 虫害抵抗性 / 細胞間シグナル伝達 / MAPキナーゼ |
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| 研究実績の概要 |
ニジュウヤホシテントウによって加害されたベンサミアナタバコ葉では、抵抗性が誘導される。ベンサミアナタバコ葉のMAPKを一過的にサイレンシングしたところ、ニジュウヤホシテントウは本来食べることのできないベンサミアナを激しく加害した。さらに、MAPKバイオセンサーを開発し、時空間的にMAPKの活性化動向を観察した結果、加害部からMAPK活性を示すFRET蛍光が拡散する様子が観察された。この結果は、植物が免疫シグナルを細胞間で移行させ、集団協調的な生体防御機構を備えていることを示している。本研究では、MAPK活性の拡散を阻害するエフェクター遺伝子を網羅的に解析する。一過的にエフェクターとMAPKセンサーを導入した葉にニジュウヤホシテントウを放飼し、あるいはニジュウヤホシテントウから精製したHAMPでFRET蛍光を観察してシグナルの拡散を抑制するエフェクター遺伝子をスクリーニングする。
ジャガイモ疫病菌は、多くのエフェクターを分泌して植物の様々なシグナル伝達因子を抑制することで感染を支えている。エフェクター遺伝子で形質転換したアグロバクテリウムと、MAPKセンサーで形質転換したアグロバクテリウムとを混合し、ベンサミアナ葉内に注入する。エフェクターとMAPKセンサーを導入した葉をHAMPで処理し、蛍光顕微鏡下でFRET蛍光を観察してシグナルの拡散が抑制されるエフェクター遺伝子をスクリーニングする。
得られたエフェクターが標的とするベンサミアナタバコ因子を酵母ツーハイブリッド法によって獲得する。標的因子をサイレンシングしたベンサミアナタバコ葉において、食害またはHAMPに対するFRET蛍光を観察する。有意にFRET蛍光の細胞間移行シグナルが抑制された場合、その標的因子はMAPK活性の細胞間移行を担うものと思われる。これらの結果を踏まえて、植物免疫シグナルの細胞間移行機構の分子基盤を築く。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ジャガイモ疫病菌 (Phytophthora infestans) はジャガイモ疫病の原因菌であり、半活物寄生的な感染様式を示す。ジャガイモ疫病菌は植物への感染時に、200種以上のエフェクターと呼ばれるタンパク質を分泌し、植物の免疫機構を抑制すると考えられている。このようなエフェクターの中には、隣接細胞のMAPKの活性化を抑制するものが含まれると考えた。ニジュウヤホシテントウの食害による隣接細胞への時空間的MAPKの活性化を、傷害処理とHAMPの同時処理によって模倣することができた。このシステムを用いることで、隣接細胞のMAPKの活性化を抑制するジャガイモ疫病菌エフェクターを探索することが可能になると考えた。
エフェクターのシグナルペプチドを排し、過剰発現型バイナリーベクターに導入し、そのプラスミドをアグロバクテリウムに導入した。エフェクターを発現するアグロバクテリウムと、細胞質局在型MAPKセンサーを発現するアグロバクテリウムのそれぞれの菌液を混合し、ベンサミアナ葉に一過的に導入した。そのベンサミアナ葉にHAMPを滴下し、その上からパターンホイールで傷害処理した。MAPKセンサーを用いた対照区では、傷害処理部から周辺の細胞へFRET蛍光の拡散が確認された。一方、各種エフェクターを導入した場合、５つのエフェクターを発現させた区においてFRET蛍光の拡散が抑制された。
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| 今後の研究の推進方策 |
ジャガイモ疫病菌は、多くのエフェクターを分泌して植物の様々なシグナル伝達因子を抑制することで感染を支えている。最近の植物免疫研究においては、様々なエフェクターに対する植物の相互作用因子を探ることによって、未知の免疫シグナル因子を得ることに成功している。本研究においても、エフェクターを用いることによって、咀嚼昆虫に対する植物の免疫シグナル因子を獲得できるものと考えた。
様々なエフェクター遺伝子で形質転換したアグロバクテリウムと、MAPKセンサーで形質転換したアグロバクテリウムとを混合し、ベンサミアナ葉内に注入し、形質転換した。エフェクターとMAPKセンサーを導入した葉をHAMPで処理し、蛍光顕微鏡下でFRET蛍光を観察してシグナルの拡散が抑制されるエフェクター遺伝子をスクリーニングした。その結果、５つのエフェクターが得られた。
今後は、得られたエフェクターが標的とするベンサミアナタバコ因子を酵母ツーハイブリッド法によって獲得する。標的因子をサイレンシングしたベンサミアナタバコ葉において、食害またはHAMPに対するFRET蛍光を観察する。有意にFRET蛍光の細胞間移行シグナルが抑制された場合、その標的因子はMAPK活性の細胞間移行を担うものと思われる。これらの結果を踏まえて、植物免疫シグナルの細胞間移行機構の分子基盤を築く。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度の研究は、前倒しで進めることができたが、一方で、次年度に遺伝子、タンパク質合成に関わる多額の費用を必要とすることが懸念された。そこで、最終年度である本年度は、合成遺伝子、酵母ツーハイブリッドに関するキットを発注し、研究を効率よく推進する予定である。
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