| 研究課題/領域番号 |
20K21359
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| 研究機関 | 帯広畜産大学 |
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研究代表者 |
西川 義文 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 教授 (90431395)
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| 研究分担者 |
渡邉 謙一 帯広畜産大学, 畜産学部, 助教 (10761702)
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| 研究期間 (年度) |
2020-07-30 – 2023-03-31
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| キーワード | 原虫 / ネオスポラ / ワクチン / ベクター |
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| 研究実績の概要 |
免疫学の発展によりウイルスや細菌に対する各種ワクチンが開発されているが、原虫病に対するワクチン開発は困難を極めている。近年の遺伝子編集技術の開発・進歩により様々な生物種への遺伝子導入や遺伝子破壊が容易となり、原虫の研究分野においても遺伝子を欠損させることでその病原性を弱めることが可能となってきた。そこで本研究では我々が確立した遺伝子編集技術を基盤として、原虫独自の代謝経路と感染伝搬能力を欠損させた次世代のワクチン株を作出し、さらにそのワクチン株に異種抗原遺伝子を組み込んだ原虫ベクターワクチン株を開発することにより様々な難治性原虫病の制圧及び癌ワクチン開発を目指している。これまでに以下の項目を明らかにした。
【増殖能力が欠損した原虫株の作出（NeoUA株）】ネオスポラの増殖に必須なピリミジン代謝経路に関与する酵素orotidine-5’-monophosphate decarboxylase (OMPDC)遺伝子の欠損株を作製した。本欠損株はsalvage経路に依存するウラシル要求性株（NeoUA株）となり、ウラシル非存在下では培養細胞内で増殖が顕著に抑制されることを確認した。
【感染伝搬能力が欠損し潜伏感染できない原虫株の作出(NeoMD株)】単球の活性化に関与する原虫分子を同定し、当該分子欠損株（NeoMD株）の性状解析を行った。その結果、本原虫因子は炎症反応に関与するインフラマソームの活性化に関与することが明らかとなった。NeoMD株は原虫の脳組織への伝搬効率が減少し、妊娠期の感染に伴う垂直感染の能力も低下していることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
【増殖能力が欠損した原虫株の作出（NeoUA株）】細胞内寄生原虫が宿主細胞内で増殖するためにはピリミジン代謝経路が必須であり、de novo経路の律速酵素であるorotidine-5’-monophosphate decarboxylase (OMPDC)遺伝子を破壊することにより、salvage経路に依存するウラシル要求性株（NeoUA株）の作出を試みた。哺乳動物ではウラシル濃度が極めて低いため、NeoUA株が増殖できず病原性が低下することが想定される。ここでは、ネオスポラで使用するために独自に設計したCRISPR-Cas9システムによりOMPDC破壊株を作出し、ウラシル非存在下では培養細胞内で増殖が顕著に抑制されることを確認した。
【感染伝搬能力が欠損し潜伏感染できない原虫株の作出(NeoMD株)】ネオスポラは感染部位（末梢）で単球などの免疫細胞に捕食され、循環血を経由して全身に伝搬し、最終的には脳組織で原虫ステージをタキゾイトからブラディゾイトへ変換して潜伏感染を成立させる。ネオスポラ感染単球が脳へ移動するためには、脳由来の誘引物質が原虫感染単球に反応することが想定される。ネオスポラ感染マウスの脳組織では免疫細胞の遊走に関与する各種ケモカイン（Cxcl9, Ccl8, Ccl5）の遺伝子発現が増加していた。今回、単球の活性化に関与する原虫分子を同定し、当該分子欠損株（NeoMD株）の正常解析を行った。その結果、本原虫因子は炎症反応に関与するインフラマソームの活性化に関与することが明らかとなった。NeoMD株は原虫の脳組織への移動が減少し、妊娠期の感染に伴う垂直感染の能力も低下していることが明らかとなった。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度は以下の研究課題を実施する。
【ネオスポラ感染に対するワクチン効果の検証】
NeoUA株、NeoMD株に加え、NeoMD株のOMPDCを破壊したNeuMD-UA株を作出し、実験マウスへ感染させ病原性を解析する。ここでは、原虫の接種量・接種回数と接種部位（腹腔、皮下、筋肉）の検討を行う。雄マウス及び妊娠・非妊娠雌マウスへ感染させ、マウスの生存率と組織の病理組織学的解析を実施し、親株原虫の感染での結果と比較することで、遺伝子破壊による原虫の病原性の変化を解析する。妊娠マウスについては、妊娠率、出産率、仔マウスの生存率も評価する。次に病原性を示さなかった弱毒化株を雄マウス及び非妊娠雌マウスへ接種し、高病原性ネオスポラ株の攻撃試験を行いマウスの生存率を評価する。さらに雌マウスへ弱毒化株を接種し、交配後妊娠中期（妊娠7-9日）に高病原性ネオスポラ株の攻撃試験を行い母親マウスと仔マウスの生存率を評価する。これらの解析により流産率や垂直感染率が低下することを確認したワクチン株を選定する。ワクチン株と親株、熱処理原虫で感作させた免疫細胞の比較トランスクリプトームにより、ワクチン効果に必要な宿主応答を解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナ感染拡大のため参加予定であった日本獣医学会学術集会がWeb開催となったため、旅費を使用しなかった。今年度に開催される別の学会への参加に使用する予定である。
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