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CRISPR/Cas9を始めとするゲノム編集技術により、これまでに様々な遺伝子改変動物が作られるようになってはいるものの、相同組換えによる大きなフラグメントのノックインは依然として効率が悪いことが知られている。 申請者が所属する滋賀医科大学では、カニクイザルにおけるゲノム編集研究を積極的に推進しているが、サルを用いる場合、マウスのように単純に試行数を増やすことで効率の問題を回避するということが倫理的に難しく、現状の効率ではノックイン実験は難しい状況である。 本研究では、内在性の相同組換え機構に注目し、それをノックインに応用することで高効率な遺伝子改変技術を確立することを目的とした。 もし効率よくノックインを誘導することが可能になれば、カニクイザルを含めた大動物のみならず、全てを置き換えるポテンシャルを秘めた意欲的な研究である。
本研究では、ノックイン効率をいかに効率よく評価するかが重要となる。そこで昨年度、恒常的発現遺伝子あるいは初期胚で高発現している遺伝子の遺伝子座にレポーターをノックインする評価系を構築したが、本年度では、この評価系のさらなる改良を行った。
次に、内在性の相同組換え機構において働くことが知られている複数の遺伝子、および内在性の相同組換えに近い状態に誘導するために、相乗的に働く因子のクローニングを行い、dCas9との融合タンパク質を発現するベクターを構築し、上記の評価系でノックイン効率の評価を行った。
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