超高精度光神経操作に向けたナトリウム選択的オプトジェネティクスツールの創製

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 20K21383
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 井上 圭一 東京大学, 物性研究所, 准教授 (90467001)
• 研究期間 (年度): 2020-07-30 – 2023-03-31
• キーワード: ロドプシン / レチナール / オプトジェネティクス / ナトリウムポンプ / ヘリオロドプシン

研究実績の概要

本研究では、Na+のみを高効率で細胞内へ輸送する、細胞内pHの変化など副次効果のない次世代のオプトジェネティクスツールとしての応用が期待される、新たなロドプシンの開発を行う。そのため、2018年に研究代表者の井上らが見出した、既存のロドプシンと膜内での配向が逆転したヘリオロドプシン（HeR）の構造を参考に、外向きナトリウムポンプ型ロドプシン（NaR）の細胞質側および細胞外側表面のアミノ酸の電荷バランスを変えることでタンパク質の配向を逆転し、内向きNa+ポンプへと機能転換することを目標とする。
2020年度は、まず研究協力者の古賀（分子研）によって、BEdep_AAProf法を用いてHeRと同様の位置に、正電荷を持つアルギニンやリジン残基を導入したNaRの配列を多数デザインした。そしてTOPCONSやPhiliusなどを用いて、配向性を評価したところ、細胞膜中での配向の反転が期待される分子が見出された。
そこでその結果をもとに井上らがNaRの変異体の作製を行った。まずBEdep_AAProf法で提案された変異を全て導入した変異体を作製したが、その場合大腸菌中でNaRの発現が大きく阻害される結果となった。そこでボトムアップ的にポイントミューテーションを重ねていく形で、変異体の構築を進めることとした。その結果各位置の変異を1つずつ導入する場合においては、タンパク質の発現量に大きな変化がないことが示され、さらに変異数を増やして５重変異体まで作製を進めることができた。一方、全変異からひとつずつ変異数を減らすアプローチにおいては、10重変異体では弱いながら、タンパク質の発現が確認された。
これらの分子は野生型NaRと比べ、細胞膜内での分子配向の変化が期待されることから、次年度以降において実験的に配向を評価するとともに、配向の変化が見られたものについてはイオン輸送活性の評価を行う。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2020年度は、まず研究協力者の古賀（分子研）によって、BEdep_AAProf法を用いて、HeRと同様の位置に、正電荷を持つアルギニンやリジン残基を導入したNaRの配列を多数デザインした。そしてTOPCONSやPhiliusなどを用いて、配向性を評価したところ、細胞膜中での配向の反転が期待される分子が見出された。この分子では19か所のアミノ酸の電荷バランスが変化し、特にN末端側表面が正に帯電したものであった。
続いて上記の結果をもとに井上らがNaRの変異体の作製を行った。まずBEdep_AAProf法で提案された19か所の変異を全て導入した変異体を作製したが、その場合大腸菌中でNaRの発現が大きく阻害される結果となった。そこでボトムアップ的にポイントミューテーションを重ねていく形で、変異体の構築を進めることとした。その結果19か所の変異を1つずつ導入する場合においては、タンパク質の発現量に大きな変化がないことが示され、さらに変異数を増やしていった結果、野生型とほぼ変わらないレベルの発現を示す５重変異体を７種類得ることに成功した。一方、全変異からひとつずつ変異数を減らすアプローチにおいては、10重変異体では弱いながら、タンパク質の発現が確認された。

今後の研究の推進方策

今年度作製を行った７種類の５重変異体と１種類の10重変異体は、野生型NaRと比べ細胞膜内での分子配向の変化が期待されることから、次年度以降において実験的に配向を評価する。そして実際に配向の変化が見られたものについてはイオン輸送活性の評価を行い、内向きNa+ポンプとして機能する分子を探索する。いずれの分子も良好な反転が見られなかった場合には、さらなるアミノ酸変異の最適化を試みる。

研究成果

• [雑誌論文] TAT Rhodopsin is a UV-Dependent Environmental pH Sensor (2021)
  • 著者名/発表者名: Chihiro Kataoka, Teppei Sugimoto, Shunta Shigemura, Kota Katayama, Satoshi P. Tsunoda, Keiichi Inoue, Oded Beja, Hideki Kandori
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 60 ページ: 899-907
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.0c00951
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Exploration of Natural Red-shifted Rhodopsins Using a Machine Learning-based Bayesian Experimental Design (2021)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Masayuki Karasuyama, Ryoko Nakamura, Masae Konno, Daichi Yamada, Kentaro Mannen, Takashi Nagata, Yu Inatsu, Hiromu Yawo, Kei Yura, Oded Beja, Hideki Kandori, Ichiro Takeuchi
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 ページ: 362
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01878-9
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Time-Resolved Serial Femtosecond Crystallography Reveals Early Structural Changes in Channelrhodopsin (2021)
  • 著者名/発表者名: K. Oda, T. Nomura, T. Nakane, K. Inoue, S. Ito, J. Vierock, ... R. Ishitani, S. Hayashi, H. Kandori, P. Hegemann, S. Iwata, M. Kubo, T. Nishizawa, O. Nureki
  • 雑誌名: eLife 巻: 10 ページ: e62389
  • DOI: 10.7554/eLife.62389
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Crystal Structure of Schizorhodopsin Reveals Mechanism of Inward Proton Pumping (2021)
  • 著者名/発表者名: Akimitsu Higuchi, Wataru Shihoya, Masae Konno, Tatsuya Ikuta, Hideki Kandori, Keiichi Inoue, Osamu Nureki
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 巻: 118 ページ: e2016328118
  • DOI: 10.1073/pnas.2016328118
  • 査読あり
• [雑誌論文] Schizorhodopsins: A Novel Family of Rhodopsins from Asgard archaea that Function as Light-Driven Inward H+ Pumps (2020)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue, Satoshi P. Tsunoda, Manish Singh, Sahoko Tomida, Shoko Hososhima, Masae Konno, Ryoko Nakamura, Hiroki Watanabe, Paul-Adrian Bulzu, Horia L. Banciu, Adrian-Stefan Andrei, Takayuki Uchihashi, Rohit Ghai, Oded Beja, Hideki Kandori
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 6 ページ: eaaz2441
  • DOI: 10.1126/sciadv.aaz2441
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Gate-Keeper of Ion Transport - a Highly Conserved Helix-3 Tryptophan in a Channelrhodopsin Chimera, C1C2/ChRWR (2020)
  • 著者名/発表者名: Yujiro Nagasaka, Shoko Hososhima, Naoko Kubo, Takashi Nagata, Hideki Kandori, Keiichi Inoue, Hiromu Yawo
  • 雑誌名: Biophysics and Physicobiology 巻: 17 ページ: 59-70
  • DOI: 10.2142/biophysico.BSJ-2020007
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Excitonic Coupling Effect on the Circular Dichroism Spectrum of Sodium-Pumping Rhodopsin KR2 (2020)
  • 著者名/発表者名: Kazuhiro J. Fujimoto, Keiichi Inoue
  • 雑誌名: The Journal of Chemical Physics 巻: 153 ページ: 45101
  • DOI: 10.1063/5.0013642
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Active Learning of Bayesian Linear Models with High-Dimensional Binary Features by Parameter Confidence-Region Estimation (2020)
  • 著者名/発表者名: Yu Inatsu, Masayuki Karasuyama, Keiichi Inoue, Hideki Kandori, Ichiro Takeuchi
  • 雑誌名: Neural Computation 巻: 32 ページ: 1998-2031
  • DOI: 10.1162/neco_a_01310
  • 査読あり
• [雑誌論文] Active Learning for Level Set Estimation Under Input Uncertainty and Its Extensions (2020)
  • 著者名/発表者名: Yu Inatsu, Masayuki Karasuyama, Keiichi Inoue, Ichiro Takeuchi
  • 雑誌名: Neural Computation 巻: 32 ページ: 2486-2531
  • DOI: 10.1162/neco_a_01332
  • 査読あり
• [雑誌論文] Shining light on rhodopsin selectivity: How do proteins decide whether to transport H+ or Cl-? (2020)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 雑誌名: The Journal of Biological Chemistry 巻: 295 ページ: 14805-14806
  • DOI: 10.1074/jbc.H120.016032
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression Analysis of Microbial Rhodopsin-like Genes in Guillardia theta (2020)
  • 著者名/発表者名: Masae Konno, Yumeka Yamauchi, Keiichi Inoue, Hideki Kandori
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 15 ページ: e0243387
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0243387
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] ISSPワークショップ「物性科学におけるデータ科学の今と未来」 (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: タンパク質のボトムアップ機能向上への機械学習法の応用
  • 招待講演
• [学会発表] BPS - Biophysical Society 65th Annual Meeting (2021)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: Photobiology of new microbial rhodopsins
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 第3回晝間輝夫光科学賞・令和2年度研究助成金贈呈式 (2021)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 新奇な微生物型ロドプシンの光機能およびその光反応メカニズム
  • 招待講演
• [学会発表] 第72回日本生物工学会大会・シンポジウム「ボトムアップ生物工学」 (2020)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 光駆動タンパク質ロドプシンの分子機能エンジニアリング
  • 招待講演
• [学会発表] 第58回日本生物物理学会年会・シンポジウム「Biomolecular Design to Control Their Functions」 (2020)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 微生物ロドプシンの機能と色の制御
  • 招待講演
• [学会発表] 第58回日本生物物理学会年会 (2020)
  • 著者名/発表者名: 永田 崇、烏山 昌幸、竹内 一郎、中島 悠、吉澤 晋、井上 圭一
  • 学会等名: Mutational analysis of the mechanism of an absorption red shift in a marine bacterial Cl--pumping rhodopsin
• [学会発表] 第58回日本生物物理学会年会 (2020)
  • 著者名/発表者名: 今野 雅恵、八尾 寛、神取 秀樹、井上 圭一
  • 学会等名: Development of a light regulatory system of membrane potential in plant cells
• [学会発表] 第58回日本生物物理学会年会 (2020)
  • 著者名/発表者名: 長坂 勇次郎、細島 頌子、神取 秀樹、井上 圭一、八尾 寛
  • 学会等名: The gate-keeper role of a highly conserved helix-3 tryptophan for ion transport of the channelrhodopsin chimera, C1C2/ChRWR
• [学会発表] 第58回日本生物物理学会年会 (2020)
  • 著者名/発表者名: 萬年 健太郎、永田 崇、Oded Beja、井上 圭一
  • 学会等名: Biophysical characterization of different members of TAT rhodopsins: a new group of microbial rhodopsins
• [学会発表] MPI-FKF Seminar (2020)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: Sir Martin Wood Prize Lecture: The emerging world of microbial rhodopsins in photobiology
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] MRC LMB Seminar (2020)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 学会等名: Sir Martin Wood Prize Lecture: The emerging world of microbial rhodopsins in photobiology
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 第43回日本分子生物学会年会 (2020)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一、志甫谷 渉、今野 雅恵、樋口 晶光、但馬 聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、永田 崇、八尾 寛、川村 出、神取 秀樹、濡木 理
  • 学会等名: 光駆動型内向きプロトンポンプ、シゾロドプシンのプロトン輸送メカニズム
• [学会発表] 日本生体エネルギー研究会第46回討論会 (2020)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一、志甫谷 渉、今野 雅恵、樋口 晶光、但馬 聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、永田 崇、八尾 寛、川村 出、神取 秀樹、濡木 理
  • 学会等名: 光駆動型内向きH+ポンプ型シゾロドプシンのH+輸送メカニズムの分光及び構造研究
• [学会発表] 日本生体エネルギー研究会第46回討論会 (2020)
  • 著者名/発表者名: 永田 崇、烏山 昌幸、中島 悠、吉澤 晋、竹内 一郎、井上 圭一
  • 学会等名: 海洋性細菌のCl-ポンプロドプシンにおける波長制御メカニズムの変異体解析
• [学会発表] 日本生体エネルギー研究会第46回討論会 (2020)
  • 著者名/発表者名: 萬年 健太郎、永田 崇、戸叶 貴也、内橋 貴之、Oded Beja、井上 圭一
  • 学会等名: TATロドプシンのpKaと多量体形成の制御における保存されたグルタミン酸の役割
• [学会発表] 日本バイオインダストリー協会・発酵と代謝研究会勉強会 (2020)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一
  • 学会等名: 微生物ロドプシンの吸収波長の自在制御に向けた機械学習法の開発
  • 招待講演
• [学会発表] 日本化学会 第101春季年会 (2021) (2020)
  • 著者名/発表者名: 井上 圭一、志甫谷 渉、今野 雅恵、樋口 晶光、但馬 聖也、古谷 祐詞、川﨑 佑真、永田 崇、八尾 寛、川村 出、神取 秀樹、濡木 理
  • 学会等名: アスガルド古細菌の持つ新奇光駆動型内向きプロトンポンプ、シゾロドプシンの輸送メカニズム
• [図書] Optogenetics: Light-Sensing Proteins and Their Applications in Neuroscience and Beyond (2021)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Inoue
  • 総ページ数: 37
  • 出版者: Springer Nature
  • ISBN: 978-981-15-8763-4
• [備考] 東京大学物性研究所・井上研究室
  • URL: https://inoue.issp.u-tokyo.ac.jp/index.html